マイコバクテリアのEVを濃縮することで、その内容の解明、派閥の解明、そして主にワクチン候補を利用する組換えEVの構築と生成の方法を設計することができます。6つの系列は、バクテリア表面の異なる位置から生成されます。保存されたマーカーはありません。
したがって、アフィニティベースのアプローチでは、EVのサブセットしか強化できません。これに対し、本手法では、生成したマイコバクテリアEVをすべて捕捉します。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるMohd Ilyasです。
まず、野生型または組換えマイコバクテリウム・スメグマチスのグリセロールストック1ミリリットルを、予熱した7H9ブロス10ミリリットルを含む50ミリリットルの遠心チューブに加えます。蓋を閉め、チューブを渦巻かせてから、摂氏37度で200〜220RPMで培養液を一晩インキュベートします。翌日、600ナノメートルでの光学濃度が約1に達したら、培養液を3,200gで室温で10分間遠心分離し、上澄み液を液体廃棄容器に廃棄する。
予め温めたSautons培地1ミリリットルを加え、静かに再懸濁して均一な懸濁液を得ます。Sautons培地を使用して容量を10ミリリットルに構成します。再度遠心分離し、上清を廃棄する。
洗浄後、細菌細胞を再懸濁します。予め温めた20ミリリットルのソートン培地で、600ナノメートルの光学密度を測定します。330ミリリットルのソートン培地を含む1〜2リットルの三角フラスコに必要量の細菌懸濁液を接種し、光学濃度が0.3に達するまで摂氏37度、200RPMでインキュベートします。
翌日、以前に示したように細胞を一度洗浄し、1/10 Tween 80を含む330ミリリットルのソートンにペレットを再懸濁します。50ミリリットルの細胞懸濁液を6つの1リットルフラスコに分配し、それぞれに1/10 Tween 80を含む280ミリリットルの予熱したオートンを入れます。光学濃度が2〜2.5に達するまで、摂氏37度、200RPMで培養物をインキュベートします。
400ミリリットルのボトル6本に2リットルの指数関数的培養物を加え、8, 000Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。上清と事前に冷却したオートクレーブ滅菌したフラスコまたはビーカーを回収し、分析手順のためにペレットのアリコートを保管します。ペレットは、EVがmCherryの組換え体の場合は着色され、非蛍光タンパク質の野生型または組換え体の場合は茶色になります。
培養上清を0.45ミクロンの廃棄フィルターでろ過し、続いて0.22ミクロンのフィルターでろ過して、バクテリアの痕跡をすべて除去します。次に、30キロダルトンのメンブレン濃縮器を15ミリリットルの二重蒸留水で4, 000Gで摂氏4度で20分間予洗します。次に、同じ条件で15ミリリットルの事前にろ過された冷たいオートン培地で洗浄し、化学物質の痕跡をすべて除去します。
洗浄後、15ミリリットルの濾過培養上清を濃縮器に加え、摂氏4度で20分間、4, 000Gで濃縮する。濃縮液を冷たい40ミリリットルのオークリッジ遠心分離管または50ミリリットルの新鮮なファルコン遠心分離管に移します。2リットルの培養濾液全体が濃縮されたら、濃縮液を二重蒸留、洗浄、および予冷した50ミリリットルのポリプロピレン遠心分離管に移し、2段階の遠心分離にかけます。
最初に 4 、 000 G で、次に 15 、 000 G.Transfer で遠心分離された濃縮物を事前に冷やした 38.5 ミリリットルの超遠心チューブに入れ、 100 、 000 G で 4 °C で 4 時間回転させます。上清を、あらかじめ冷やした50ミリリットルの新鮮なFalcon遠心チューブに集めます。超遠心チューブを糸くずの出ない新しい吸収紙にひっくり返して上清の痕跡を除去し、ペレットを600マイクロリットルのHEPES緩衝液に再懸濁します。
再懸濁したペレットを13 mmリットルの冷蔵済みUltraClearポリプロピレン超遠心チューブの底に重ね、4 mmリットルの不活性60%密度グラジエントイオジキサノール溶液と穏やかに混合します。次に、40%、30%、20%、および10%のヨウジキサノールをそれぞれ1ミリリットルで重ね合わせます。上部に4ミリリットルの6%ヨウジキサノールを加えてチューブを満たします。
ガラスビーカーまたはスタンドでチューブを慎重に計量した後、スイングバケットに静かに移し、次にスイングバケットローターに移して、摂氏4度で16時間、141、000Gで超遠心分離します。超遠心分離後、チューブを慎重に取り外し、1ミリリットルの画分をオートクレーブ処理した微量遠心チューブに回収します。TEM分析では、マイコバクテリアのEVが円形であることが示され、ナノトラッキング分析により、直径20〜250ナノメートルのさまざまなサイズのEVが確認されました。
mCherryのN末端がCFP-29のC末端に翻訳融合すると、Msmの濃縮されたmEVの一部がピンク色に変色し、cf-29が目的の外来タンパク質を運ぶ能力を示しました。その後、CFP-29を使用して、Msm EVへのEsxAの供給を評価しました。MtbのEsxAは、Msm EVで少量観察された。
CFP-29 EsxA 3X FLAGは、mEVでより安定し、より高いレベルで蓄積されました。生理学的に異なる条件下で増殖したマイコバクテリアからEVを濃縮することで、持続的な感染力、病原性、病原体の拡散を左右する内容の変化や機能の変化に関する洞察が得られます。
