העשרת כלי הרכב החשמליים המיקובקטריאליים מסייעת לשרטט את תכולתם, לפענח את הפלגים שלהם ולתאריכים לתכנון דרכים לבנות ולייצר כלי רכב חשמליים רקומביננטיים המנצלים בעיקר מועמדים לחיסון. שש סדרות נוצרות ממקומות שונים של פני השטח של החיידקים. אין להם סמנים שמורים.
לפיכך, כל גישה מבוססת זיקה יכולה להעשיר רק תת-קבוצה של כלי רכב חשמליים. לעומת זאת, השיטה שלנו לוכדת את כל המיקובקטריה החשמליים שנוצרו. מי שידגים את ההליך יהיה מוהד איליאס, דוקטורנט מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, הוסף מיליליטר אחד של מלאי גליצרול של Mycobacterium smegmatis מסוג בר או רקומביננטי לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מרק 7H9 שחומם מראש. סגרו את המכסה וסובבו את הצינור לפני הדגירה על התרבית למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בין 200 ל-220 סל"ד. למחרת, כאשר הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מגיע בערך אחד, צנטריפוגה את התרבית ב 3, 200 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant לתוך מיכל השלכה נוזלי.
הוסיפו מיליליטר אחד של מצע Sautons שחומם מראש והשהו מחדש בעדינות לקבלת מתלה אחיד. לפצות את עוצמת הקול עד 10 מיליליטר באמצעות מדיה Sautons. שוב צנטריפוגה והשליך את הסופרנטנט.
לאחר שטיפה, להשעות מחדש את תאי החיידקים. ב-20 מיליליטר של מדיה Sautons שחוממה מראש ומודדים את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר. יש לחסן את נפח התרחיף החיידקי הנדרש בבקבוק ארלנמאייר של ליטר אחד או שניים המכיל 330 מיליליטר של מצעי Sautons ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס ב-200 סל"ד עד שהצפיפות האופטית מגיעה ל-0.3.
למחרת, שטפו את התאים פעם אחת כפי שהודגם קודם לכן והשעו מחדש את הגלולה ב 330 מיליליטר של Sautons המכילים 1/10 Tween 80. מחלקים 50 מיליליטר של תרחיף התא לשש צלוחיות של ליטר אחד, שכל אחת מהן מכילה 280 מיליליטר של סאוטונים שחוממו מראש המכילים 1/10 Tween 80. דוגרים על התרביות ב-37 מעלות צלזיוס ב-200 סל"ד עד שהצפיפות האופטית מגיעה לשתיים עד 2.5.
הוסף שני ליטרים של תרביות בשלב הביניים לשישה בקבוקים של 400 מיליליטר וצנטריפוגה ב 8, 000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אספו את הצלוחיות או הכוסות האוטוקלאביות הסופרנאטנטיות והצוננות מראש ואחסנו אליציטוט של הגלולה להליכים אנליטיים. הגלולה צבועה אם כלי הרכב החשמליים רקומביננטיים עבור mCherry וחומים אם הם מסוג פראי או רקומביננטיים עבור חלבונים שאינם פלואורסצנטיים.
סננו את תרבית העל דרך מסנן סילוק של 0.45 מיקרון, ולאחר מכן סיננו דרך מסנן של 0.22 מיקרון כדי להסיר את כל עקבות החיידקים. לאחר מכן, לשטוף מראש את רכזי קרום 30 קילודלטון עם 15 מיליליטר של מים מזוקקים כפול ב 4, 000 גרם במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף עם 15 מיליליטר של מדיה Sautons קר מסונן מראש באמצעות אותם תנאים כדי להסיר את כל עקבות של כימיקלים.
לאחר הכביסה, להוסיף 15 מיליליטר של supernatant מתורבת מסונן לתוך רכז ולהתרכז ב 4, 000 גרם במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את התרכיז לצינור צנטריפוגה קר של אוק רידג' בקוטר 40 מ"מ או לצינור צנטריפוגת פלקון טרי בקוטר 50 מיליליטר. לאחר ריכוז כל שני ליטר תסנין התרבית, מעבירים את התרכיז לצינור צנטריפוגת פוליפרופילן 50 מיליליטר מזוקק כפול, שטוף ומצונן מראש ונתון לצנטריפוגה דו-שלבית.
תחילה ב 4, 000 G, ולאחר מכן ב 15, 000 G.להעביר את התרכיז צנטריפוגה לתוך צינור אולטרה צנטריפוגה 38.5 מיליליטר מקורר מראש להסתובב ב 100, 000 G במשך ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס. אספו את הסופרנאטנט בצינור צנטריפוגת פלקון טרי של 50 מיליליטר מקורר מראש. הפוך את צינור האולטרה-צנטריפוגה על נייר סופג טרי ללא סיבים כדי להסיר עקבות של הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-600 מיקרוליטר של חיץ HEPES.
הניחו את הגלולה המרחפת בתחתית צינור אולטרה-צנטריפוגה מפוליפרופילן אולטרה-צנטריפוגה מקורר מראש של 13 מיליליטר וערבבו בעדינות עם ארבעה מיליליטר של תמיסת יודיקסנול הדרגתית אינרטית בצפיפות של 60%. לאחר מכן שכבה עם מיליליטר אחד כל אחד של 40%30%, 20% ו 10% של יודיקסנול. מלאו את הצינור על ידי הוספת ארבעה מיליליטר של 6% יודיקסנול בחלק העליון.
לאחר שקילה זהירה של הצינור בכוס זכוכית או מעמד, העבירו אותו בעדינות לדליים המתנדנדים ולאחר מכן לרוטור דליי המתנדנד עבור אולטרה-צנטריפוגה ב 141, 000 גרם למשך 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר אולטרהצנטריפוגה, בזהירות להסיר את הצינור ולאסוף חלק אחד מיליליטר לתוך צינורות microcentrifuge autoclaved. ניתוח TEM הראה כי כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים הם מעגליים וניתוח ננו-מעקב אישר כי כלי רכב חשמליים בגדלים שונים עם קטרים הנעים בין 20 ל-250 ננומטר.
כאשר קצה N-terminal של mCherry אוחה באופן תרגומי לקצה C-terminal של CFP-29, חלק מה-mEV המועשר של Msm הפך ורוד, מה שמצביע על יכולתו של cf-29 לשאת חלבון זר בעל עניין. CFP-29 שימש אז להערכת אספקת EsxA לרכבים חשמליים מסוג Msm. EsxA של Mtb נצפה ברכבים חשמליים מסוג Msm בכמויות נמוכות.
CFP-29 EsxA 3X FLAG היה יציב יותר והצטבר ברמות גבוהות יותר ב-mEVs. העשרת כלי הרכב החשמליים ממיקובקטריה הגדלים בתנאים פיזיולוגיים שונים מספקת תובנות לגבי התוכן המשתנה שלהם ותפקודים משתנים המכתיבים זיהומיות מתמשכת, פתוגנזה והתפשטות פתוגנים.
