마이코박테리아 EV를 강화하면 내용물을 설명하고, 파벌을 해독하고, 주로 백신 후보를 활용하는 재조합 EV를 구성하고 생성하는 방법을 설계하는 데 도움이 됩니다. 6개의 계열은 박테리아 표면의 다른 위치에서 생성됩니다. 보존된 마커가 없습니다.
따라서 모든 선호도 기반 접근 방식은 EV의 하위 집합만 강화할 수 있습니다. 대조적으로, 우리의 방법은 생성된 모든 마이코박테리아 EV를 포착합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Mohd Ilyas입니다.
먼저 예열된 10H9 육수가 들어 있는 50밀리리터 원심분리 튜브에 야생형 또는 재조합 Mycobacterium smegmatis의 글리세롤 스톡 1밀리리터를 추가합니다. 뚜껑을 닫고 튜브를 휘젓고 섭씨 37도에서 200-220RPM 사이의 배양액을 밤새 배양합니다. 다음날 600 나노 미터의 광학 밀도가 약 1에 도달하면 실온에서 3, 200 G에서 10 분 동안 배양 물을 원심 분리하고 상층액을 액체 폐기 용기에 버립니다.
미리 예열된 Sautons 매체 1밀리리터를 추가하고 균일한 현탁액을 얻기 위해 부드럽게 재현탁합니다. Sautons 매체를 사용하여 부피를 10밀리리터로 구성하십시오. 다시 원심분리하고 상층액을 버립니다.
세척 후 박테리아 세포를 재현탁하십시오. 20 밀리리터의 사전 데워진 Sautons 매체에 넣고 600 나노 미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 필요한 양의 박테리아 현탁액을 330 밀리리터의 Sautons 배지가 들어있는 1-2 리터의 삼각 플라스크에 접종하고 광학 밀도가 0.3에 도달 할 때까지 섭씨 37도에서 200 RPM으로 배양합니다.
다음 날, 앞서 설명한 대로 세포를 한 번 세척하고 1/10 트윈 80을 포함하는 330밀리리터의 Sautons에 펠릿을 재현탁시킵니다. 셀 현탁액 50밀리리터를 1리터 플라스크 6개에 분배하고, 각 플라스크에는 1/10 트윈 80이 들어 있는 280밀리리터의 예열된 소우톤이 들어 있습니다. 섭씨 37도에서 200RPM으로 배양물을 2-2.5에 도달할 때까지 배양합니다.
6개의 400 밀리리터 병에 중간 지수 단계 배양액 2리터를 추가하고 섭씨 4도에서 20분 동안 8, 000G에서 원심분리합니다. 상층액 및 사전 냉각된 오토클레이브 플라스크 또는 비커를 수집하고 분석 절차를 위해 펠릿의 부분 표본을 저장합니다. 펠릿은 EV가 mCherry에 대해 재조합 된 경우 착색되고 야생형 인 경우 갈색이거나 비 형광 단백질에 대해 재조합 된 경우 갈색입니다.
0.45미크론 폐기 필터를 통해 배양 상층액을 여과한 다음 0.22미크론 필터를 통해 여과하여 박테리아의 모든 흔적을 제거합니다. 다음에, 4에 두 배 증류한 물의 15 밀리리터를 가진 30 킬로달톤 막 집중 장치를 4 섭씨 온도에 20 분 동안 000 G를 전 세척하십시오. 그런 다음 동일한 조건을 사용하여 사전 여과된 15ml의 차가운 Sautons 매체로 세척하여 모든 화학 물질의 흔적을 제거합니다.
세척 후에, 집중 장치로 걸러진 경작한 상층액의 15 밀리리터를 추가하고 4, 4 섭씨 온도에 20 분 동안 000 G에 집중하십시오. 농축액을 차가운 40밀리리터의 Oak Ridge 원심분리기 튜브 또는 50밀리리터의 새 Falcon 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 2리터의 배양 여과액 전체가 농축되면 농축액을 이중 증류, 세척 및 사전 냉각된 50밀리리터 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 옮기고 2단계 원심분리를 실시합니다.
첫째로 4, 000 G에, 그리고 그 후에 15에, 000 G.Transfer 전 식힌 38.5 밀리리터 ultracentrifuge 관으로 분리한 농축액은 100, 4 섭씨 온도에 4 시간 동안 000 G를 회전시킨다. 미리 냉각된 50밀리리터의 신선한 Falcon 원심분리기 튜브에 상층액을 수집합니다. 초원심분리기 튜브를 보푸라기가 없는 신선한 흡수성 종이에 뒤집어 상층액의 흔적을 제거하고 펠릿을 600마이크로리터의 HEPES 완충액에 다시 현탁시킵니다.
13밀리리터의 사전 냉각된 UltraClear 폴리프로필렌 초원심분리기 튜브의 바닥에 재현탁 펠릿을 겹쳐 놓고 4밀리리터의 불활성 60% 밀도 구배 요오딕산올 용액과 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 40 % 30 % 20 % 및 10 %의 요오드화 산올 각각 1 밀리리터를 오버레이합니다. 상단에 4ml의 6% 요오딕산올을 추가하여 튜브를 채웁니다.
주의깊게 유리제 비커 또는 대에 있는 관의 무게를 달기 후에, 4 섭씨 온도에 141, 16 시간 동안 000 G에 ultracentrifugation를 위한 진동 물통 회전자에 그리고 그 후에 진동하는 물통 회전자에 온화하게 그것을 옮기십시오. 초원심분리 후 튜브를 조심스럽게 제거하고 1밀리리터 분획을 오토클레이브 마이크로 원심분리기 튜브에 수집합니다. TEM 분석은 마이코박테리아 EV가 원형임을 보여주었고 나노 추적 분석은 직경이 20나노미터에서 250나노미터 사이인 다양한 크기의 EV를 확인했습니다.
mCherry의 N-말단 말단이 CFP-29의 C-말단 말단에 번역적으로 융합되었을 때, Msm의 농축된 mEV의 일부가 분홍색으로 변했는데, 이는 cf-29가 관심 있는 외부 단백질을 운반할 수 있는 능력을 나타냅니다. 그런 다음 CFP-29를 사용하여 Msm EV에 대한 EsxA 제공을 평가했습니다. Mtb의 EsxA는 Msm EV에서 소량으로 관찰되었습니다.
CFP-29 EsxA 3X FLAG는 더 안정적이었고 mEV에서 더 높은 수준으로 축적되었습니다. 생리학적으로 다양한 조건에서 자란 마이코박테리아에서 EV를 농축하면 지속적인 감염성, 발병 기전 및 병원균 확산을 지시하는 변경된 내용물과 수정된 기능에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
