يساعد إثراء المركبات الكهربائية المتفطرة في تحديد محتوياتها ، وفك رموز فصائلها ، وتواريخها في تصميم طرق لبناء وتوليد المركبات الكهربائية المؤتلفة التي تستغل بشكل أساسي اللقاحات المرشحة. ست سلاسل تولد من مواقع مختلفة من سطح البكتيريا. ليس لديهم علامات محفوظة.
وبالتالي ، فإن أي نهج قائم على التقارب يمكن أن يثري فقط مجموعة فرعية من المركبات الكهربائية. في المقابل ، تلتقط طريقتنا جميع المتفطرات الكهربائية المتولدة. سيوضح الإجراء محمد إلياس ، طالب دكتوراه من مختبري.
للبدء ، أضف ملليلتر واحد من مخزون الجلسرين من النوع البري أو المتفتلف المتفطرة smegmatis إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من مرق 7H9 المسخن مسبقا. أغلق الغطاء وقم بتدوير الأنبوب قبل احتضان المزرعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية بين 200 إلى 220 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، عندما تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى واحد تقريبا ، قم بطرد مركزي للثقافة عند 3،200 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية في حاوية سائلة.
أضف ملليلترا واحدا من وسائط Sautons التي تم تسخينها مسبقا وأعد تعليقها برفق للحصول على تعليق موحد. قم بتكوين الحجم إلى 10 ملليلتر باستخدام وسائط Sautons. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وتجاهل الطاف.
بعد الغسيل ، أعد تعليق الخلايا البكتيرية. في 20 ملليلتر من وسائط Sautons الدافئة مسبقا وقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر. قم بتلقيح الحجم المطلوب من المعلق البكتيري في دورق Erlenmeyer بسعة لتر إلى لترين يحتوي على 330 ملليلتر من وسائط Sautons واحتضانه عند 37 درجة مئوية في 200 دورة في الدقيقة حتى تصل الكثافة الضوئية إلى 0.3.
في اليوم التالي ، اغسل الخلايا مرة واحدة كما هو موضح سابقا وأعد تعليق الحبيبات في 330 ملليلتر من Sautons تحتوي على 1/10 Tween 80. وزع 50 ملليلترا من معلق الخلية في ست قوارير سعة لتر واحد ، تحتوي كل منها على 280 ملليلترا من Sautons قبل التسخين تحتوي على 1/10 Tween 80. احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية في 200 دورة في الدقيقة حتى تصل الكثافة البصرية إلى 2.5.
أضف لترين من مزارع المرحلة الأسية المتوسطة إلى ست زجاجات سعة 400 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 8،000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اجمع القوارير أو الأكواب الطافية والمبردة مسبقا وقم بتخزين حصة من الحبيبات للإجراءات التحليلية. يتم تلوين الحبيبات إذا كانت المركبات الكهربائية مؤتلفة ل mCherry وبنية اللون إذا كانت من النوع البري أو المؤتلف للبروتينات غير الفلورية.
قم بتصفية طاف الاستزراع من خلال مرشح التخلص 0.45 ميكرون ، متبوعا بالترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرون لإزالة جميع آثار البكتيريا. بعد ذلك ، اغسل مسبقا مكثفات الغشاء 30 كيلو دالتون ب 15 مل من الماء المقطر المزدوج عند 4،000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل ب 15 مل من وسائط Sautons الباردة المفلترة مسبقا باستخدام نفس الظروف لإزالة جميع آثار المواد الكيميائية.
بعد الغسيل ، أضف 15 مل من المادة الطافية المستزرعة المفلترة إلى مكثف وركز عند 4،000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل المركز إلى أنبوب طرد مركزي بارد من طراز أوك ريدج سعة 40 ملليلتر أو أنبوب طرد مركزي جديد من طراز فالكون سعة 50 ملليلتر. بمجرد تركيز لترين كاملين من ترشيح المزرعة ، انقل المركز إلى أنبوب طرد مركزي مزدوج مقطر ومغسول ومبرد مسبقا سعة 50 ملليلتر من مادة البولي بروبيلين ويخضع للطرد المركزي من خطوتين.
أولا عند 4،000 جيجا ، ثم عند 15،000 G.نقل تركيز الطرد المركزي إلى أنبوب طرد مركزي فائق التبريد مسبقا 38.5 ملليلتر وتدور عند 100،000 G لمدة أربع ساعات عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي جديد من طراز فالكون سعة 50 ملليلتر مبرد مسبقا. اقلب أنبوب الطرد المركزي الفائق على ورق ماص جديد خال من النسالة لإزالة آثار المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت HEPES.
ضع طبقة من الحبيبات المعاد تعليقها في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي UltraClear UltraClear المبرد مسبقا سعة 13 ملليلتر واخلطه برفق مع أربعة ملليلتر من محلول اليوديكسانول المتدرج الخامل بكثافة 60٪. ثم تراكب مع ملليلتر واحد لكل من 40٪ 30٪ 20٪ و 10٪ من اليوديكسانول. املأ الأنبوب بإضافة أربعة ملليلتر من 6٪ يوديكسانول في الأعلى.
بعد وزن الأنبوب بعناية في دورق زجاجي أو حامل ، انقله برفق إلى الدلاء المتأرجحة ثم إلى دوار الدلاء المتأرجحة للطرد المركزي الفائق عند 141،000 جم لمدة 16 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي الفائق ، قم بإزالة الأنبوب بعناية وجمع جزء واحد ملليلتر في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقم. أظهر تحليل TEM أن المركبات الكهربائية المتفطرة دائرية وتتبع نانو أكد تحليل EVs مختلفة الأحجام بأقطار تتراوح بين 20 و 250 نانومتر.
عندما تم دمج الطرف N من mCherry بشكل متعدي مع الطرف C من CFP-29 ، تحول جزء من mEVs المخصب من MSM إلى اللون الوردي ، مما يشير إلى قدرة cf-29 على حمل بروتين غريب مهم. ثم تم استخدام CFP-29 لتقييم تسليم EsxA إلى MSM EVs. لوحظ Mtb's EsxA في MSM EVs بكميات منخفضة.
كان CFP-29 EsxA 3X FLAG أكثر استقرارا وتراكم عند مستويات أعلى في mEVs. يوفر إثراء المركبات الكهربائية من المتفطرات التي تزرع في ظل ظروف فسيولوجية مختلفة نظرة ثاقبة لمحتوياتها المتغيرة ووظائفها المعدلة التي تملي العدوى المستمرة والتسبب في المرض وانتشار مسببات الأمراض.
