Обогащение микобактериальных ВВ помогает определить их содержимое, расшифровать их фракции и даты, разрабатывая способы конструирования и создания рекомбинантных ВВ, которые в основном используют вакцины-кандидаты. Шесть серий генерируются из разных мест бактериальной поверхности. У них нет законсервированных маркеров.
Следовательно, любые подходы, основанные на сходстве, могут обогатить только подмножество EV. В отличие от этого, наш метод захватывает все сгенерированные микобактерии ВВ. Процедуру будет демонстрировать Мохд Ильяс, аспирант из моей лаборатории.
Для начала добавьте один миллилитр глицеринового бульона дикого типа или рекомбинантной Mycobacterium smegmatis в 50-миллилитровую центрифужную пробирку, содержащую 10 миллилитров предварительно подогретого бульона 7H9. Закройте крышку и покрутите пробирку, прежде чем инкубировать культуру в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия при 200-220 оборотах в минуту. На следующий день, когда оптическая плотность при 600 нм достигнет примерно единицы, центрифугируют культуру при 3,200 G в течение 10 минут при комнатной температуре и выбрасывают надосадочную жидкость в емкость для сброса жидкости.
Добавьте один миллилитр предварительно подогретого фильтрующего материала Sautons и аккуратно ресуспендируйте до получения однородной суспензии. Доведите объем до 10 миллилитров с помощью фильтрующего средства Sautons. Снова центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
После промывки повторно суспендируйте бактериальные клетки. в 20 миллилитрах предварительно нагретой среды Sautons и измерить оптическую плотность на 600 нанометров. Засейте необходимый объем бактериальной суспензии в одно-двухлитровую колбу Эрленмейера, содержащую 330 миллилитров среды Sautons, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия при 200 об/мин до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет 0,3.
На следующий день промойте клетки один раз, как показано ранее, и повторно суспендируйте гранулы в 330 миллилитрах сотонов, содержащих 1/10 Tween 80. Распределите 50 миллилитров клеточной суспензии по шести литровым колбам, каждая из которых содержит 280 миллилитров предварительно подогретых сотонов, содержащих 1/10 Tween 80. Инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия при 200 оборотах в минуту до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет от 2 до 2,5.
Добавьте два литра культур средней экспоненциальной стадии в шесть бутылок по 400 миллилитров и центрифугируйте при 8 000 G в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Соберите надосадочную жидкость и предварительно охлажденные автоклавные колбы или стаканы и храните аликвоту гранул для аналитических процедур. Гранула окрашена, если EV рекомбинантны для mCherry, и коричневой, если они дикого типа, или рекомбинантной для нефлуоресцентных белков.
Отфильтруйте культуру надосадочной жидкости через фильтр для утилизации 0,45 микрона, а затем фильтруйте через фильтр 0,22 микрона, чтобы удалить все следы бактерий. Затем предварительно промойте 30-килодальтонные мембранные концентраторы 15 миллилитрами воды двойной дистилляции при 4 000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Затем промойте 15 миллилитрами предварительно отфильтрованного холодного носителя Sautons в тех же условиях, чтобы удалить все следы химикатов.
После промывки добавьте в концентратор 15 миллилитров отфильтрованной надосадочной жидкости и концентрируйте при 4 000 г в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Перелейте концентрат в холодную 40-миллилитровую центрифужную пробирку Oak Ridge или 50-миллилитровую свежую центрифужную пробирку Falcon. После того, как все два литра фильтрата культуры будут концентрированы, переложите концентрат в 50-миллилитровую полипропиленовую центрифужную пробирку с двойной дистилляцией, промытую и предварительно охлажденную и подвергнутую двухступенчатому центрифугированию.
Сначала при 4 000 Г, а затем при 15 000 Г. Центрифугированный концентрат переложить в предварительно охлажденную ультрацентрифужную пробирку объемом 38,5 миллилитра и отжимать при 100 000 G в течение четырех часов при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость в предварительно охлажденную 50-миллилитровую свежую центрифужную пробирку Falcon. Переверните пробирку ультрацентрифуги на свежую безворсовую впитывающую бумагу, чтобы удалить следы надосадочной жидкости и повторно суспендировать гранулу в 600 микролитрах буфера HEPES.
Выложите ресуспендированную гранулу на дно 13-миллилитровой предварительно охлажденной полипропиленовой ультрацентрифужной пробирки UltraClear и осторожно смешайте с четырьмя миллилитрами инертного раствора йодиксанола с градиентом плотности 60%. Затем наложите по одному миллилитру по 40%, 30%, 20% и 10% йодиксанола. Наполните тюбик, добавив сверху четыре миллилитра 6%-ного йодиксанола.
После тщательного взвешивания пробирки в стеклянном стакане или подставке осторожно переложите ее в качающиеся ведра, а затем в ротор качающихся ведер для ультрацентрифугирования при 141 000 G в течение 16 часов при четырех градусах Цельсия. После ультрацентрифугирования осторожно извлеките пробирку и соберите фракцию в один миллилитр в автоклавные микроцентрифужные пробирки. Анализ ПЭМ показал, что ВВ микобактерий имеют круглую форму, а анализ нанослежения подтвердил, что ВВ разных размеров имеют диаметр от 20 до 250 нанометров.
Когда N-концевой конец mCherry был трансляционно слит с С-концевым концом CFP-29, часть обогащенных mEV Msm стала розовой, что указывает на способность cf-29 переносить интересующий нас чужеродный белок. Затем CFP-29 был использован для оценки доставки EsxA в электромобили MSM. EsxA от Mtb наблюдался в электромобилях Msm в небольших количествах.
CFP-29 EsxA 3X FLAG был более стабилен и накапливался на более высоких уровнях в мEV. Обогащение ВВ микобактериями, выращенными в физиологически различных условиях, дает представление об их измененном составе и измененных функциях, которые определяют устойчивую инфекционность, патогенез и распространение патогенов.
