Mikobakteriyel EV'leri zenginleştirmek, içeriklerini tanımlamaya, gruplarını deşifre etmeye ve esas olarak aşı adaylarından yararlanan rekombinant EV'ler inşa etmenin ve üretmenin yollarını tasarlamaya yardımcı olur. Altı seri, bakteri yüzeyinin farklı yerlerinden üretilir. Korunmuş belirteçleri yoktur.
Bu nedenle, herhangi bir yakınlık temelli yaklaşım, EV'lerin yalnızca bir alt kümesini zenginleştirebilir. Buna karşılık, yöntemimiz üretilen tüm mikobakteri EV'lerini yakalar. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Mohd Ilyas olacak.
Başlamak için, 10 mililitre önceden ısıtılmış 7H9 et suyu içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne bir mililitre gliserol stoğu vahşi tip veya rekombinant Mycobacterium smegmatis ekleyin. Kapağı kapatın ve kültürü gece boyunca 37 santigrat derecede 200 ila 220 RPM arasında inkübe etmeden önce tüpü döndürün. Ertesi gün, 600 nanometredeki optik yoğunluk yaklaşık bire ulaştığında, kültürü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3.200 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı sıvı bir ıskarta kabına atın.
Bir mililitre önceden ısıtılmış Sautons ortamı ekleyin ve tek tip bir süspansiyon elde etmek için hafifçe yeniden askıya alın. Sautons ortamını kullanarak hacmi 10 mililitreye çıkarın. Tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
Yıkadıktan sonra bakteri hücrelerini tekrar süspanse edin. 20 mililitre önceden ısıtılmış Sautons ortamında ve optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün. Gerekli hacimde bakteri süspansiyonunu 330 mililitre Sauton ortamı içeren bir ila iki litrelik bir Erlenmeyer şişesine aşılayın ve optik yoğunluk 0.3'e ulaşana kadar 200 RPM'de 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, hücreleri daha önce gösterildiği gibi bir kez yıkayın ve peleti 1/10 Tween 80 içeren 330 mililitre Sauton içinde yeniden süspanse edin. 50 mililitre hücre süspansiyonunu, her biri 1/10 Tween 80 içeren 280 mililitre önceden ısıtılmış Sauton içeren altı adet bir litrelik şişeye dağıtın. Kültürleri, optik yoğunluk iki ila 2.5'e ulaşana kadar 200 RPM'de 37 santigrat derecede inkübe edin.
Altı adet 400 mililitrelik şişeye iki litre orta-üstel aşama kültürü ekleyin ve dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 8.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatan ve önceden soğutulmuş otoklavlanmış şişeleri veya beherleri toplayın ve analitik prosedürler için peletin bir kısmını saklayın. EV'ler mCherry için rekombinant ise pelet renklendirilir ve vahşi tip veya floresan olmayan proteinler için rekombinant ise kahverengidir.
Kültür süpernatantını 0,45 mikronluk bir atık filtreden süzün, ardından tüm bakteri izlerini gidermek için 0,22 mikronluk bir filtreden süzün. Daha sonra, 30 kilodaltonluk membran yoğunlaştırıcıları 15 mililitre çift damıtılmış su ile 4.000 G'de dört santigrat derecede 20 dakika boyunca önceden yıkayın. Ardından, tüm kimyasal izlerini gidermek için aynı koşulları kullanarak 15 mililitre önceden filtrelenmiş soğuk Sautons ortamıyla yıkayın.
Yıkadıktan sonra, bir yoğunlaştırıcıya 15 mililitre filtrelenmiş kültürlenmiş süpernatan ekleyin ve dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 4.000 G'de konsantre edin. Konsantreyi soğuk 40 mililitrelik Oak Ridge santrifüj tüpüne veya 50 mililitrelik taze Falcon santrifüj tüpüne aktarın. İki litre kültür süzüntüsünün tamamı konsantre edildikten sonra, konsantreyi çift damıtılmış, yıkanmış ve önceden soğutulmuş 50 mililitrelik bir polipropilen santrifüj tüpüne aktarın ve iki aşamalı bir santrifüjlemeye tabi tutun.
Önce 4.000 G'de ve daha sonra 15.000 G'de santrifüjlenmiş konsantreyi önceden soğutulmuş 38.5 mililitrelik bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede dört saat boyunca 100.000 G'de döndürün. Süpernatanı önceden soğutulmuş 50 mililitrelik taze bir Falcon santrifüj tüpünde toplayın. süpernatan izlerini gidermek için ultrasantrifüj tüpünü taze, tüy bırakmayan emici bir kağıt üzerinde ters çevirin ve peleti 600 mikrolitre HEPES tamponunda yeniden süspanse edin.
Yeniden süspanse edilmiş peleti 13 mililitrelik önceden soğutulmuş UltraClear polipropilen ultrasantrifüj tüpünün dibine yerleştirin ve dört mililitre inert %60 yoğunluklu gradyan iyodiksanol çözeltisi ile hafifçe karıştırın. Daha sonra her biri bir mililitre %40, %30, %20 ve %10 iyodiksanol ile kaplayın. Üstüne dört mililitre% 6 iyodiksanol ekleyerek tüpü doldurun.
Tüpü bir cam beher veya bir stand içinde dikkatlice tarttıktan sonra, yavaşça sallanan kovalara ve ardından dört santigrat derecede 16 saat boyunca 141.000 G'de ultrasantrifüjleme için sallanan kova rotoruna aktarın. Ultrasantrifüjlemeden sonra, tüpü dikkatlice çıkarın ve otoklavlanmış mikrosantrifüj tüplerine bir mililitrelik bir fraksiyon toplayın. TEM analizi, mikobakteriyel EV'lerin dairesel olduğunu gösterdi ve nano izleme analizi, çapları 20 ila 250 nanometre arasında değişen farklı büyüklükteki EV'leri doğruladı.
mCherry'nin N-terminal ucu, CFP-29'un C-terminal ucuna translasyonel olarak kaynaştırıldığında, Msm'nin zenginleştirilmiş mEV'lerinin bir kısmı pembeye döndü ve cf-29'un ilgilenilen yabancı bir proteini taşıma yeteneğini gösterdi. CFP-29 daha sonra Msm EV'lere EsxA teslimatını değerlendirmek için kullanıldı. Mtb'nin EsxA'sı, Msm EV'lerde düşük miktarlarda gözlemlendi.
CFP-29 EsxA 3X FLAG daha kararlıydı ve mEV'lerde daha yüksek seviyelerde birikmişti. EV'lerin fizyolojik farklı koşullar altında yetiştirilen mikobakterilerden zenginleştirilmesi, sürekli enfektivite, patogenez ve patojen yayılımını belirleyen değiştirilmiş içerikleri ve değiştirilmiş işlevleri hakkında fikir verir.
