SW 是德克萨斯州癌症预防和研究所 （RR210034） 的学者并得到他们的支持

该研究方案得到了德克萨斯大学西南医学中心机构审查委员会 （IRB） 的批准。手术前获得所有患者的知情同意。
1. 试剂和材料制备
<ol><li>在通风橱中制备 0.2 N 氯化钠 （HCl） 溶液，将 8.212 mL HCl（37% w/w 或 12.1 N）缓慢加入 491.788 mL ddH2O。在室温 （RT） 下储存。 注意： 慢慢向水中加入酸。不要向酸中加水。</li>
	<li>通过将 1.47 g 柠檬酸三钠（二水合物）溶解在 400 mL ddH2O 中，制备 10 mM 柠檬酸溶液 （pH 6.0），使用 HCl 调节至 pH 6.0，然后用 ddH2O 将最终体积降至 500 mL。将缓冲液储存在 RT 中。</li>
	<li>通过将 100 μL Tween-20 添加到 900 μL ddH2O 中来制备 10% Tween-20 溶液。将其储存在 RT 中。</li>
	<li>通过将 5 mL IGEPAL CA-630 添加到 45 mL ddH2O 中来制备 10% IGEPAL 溶液。将其储存在 RT 中。</li>
	<li>通过将 44.1 g 柠檬酸三钠（二水合物）和 87.65 g 氯化钠 （NaCl） 溶解在 900 mL ddH2O 中，制备 20x SSC（pH 7.0,3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠）溶液。使用 HCl 调节至 pH 7.0，然后用 ddH2O 将最终体积降至 1000 mL。将缓冲液储存在 RT 中。</li>
	<li>通过将 100 mL 的 20x SSC 添加到 900 mL 的 ddH2O 中来制备 2x SSC 溶液。如有必要，添加 0.5 mL 防腐剂（材料表）。将其储存在 RT 中。</li>
	<li>通过混合 910 μL ddH2O、500 μL 20x SSC、50 μL 10% Tween-20、40 μL RNase A、1 mL 50% 葡聚糖硫酸盐和 2.5 mL 甲酰胺来制备探针杂交缓冲液。分装到 1 mL 中并储存在 -20 °C 下。</li>
	<li>通过混合 100 mL 的 2x SSC、15 mL 的 10% IGEPAL 和 385 mL 的 ddH2O，制备含有 0.4% IGEPAL 溶液的 0.4x SSC。</li>
	<li>通过将 5 mL 的 10% IGEPAL 添加到 495 mL 的 2x SSC 溶液中，制备含有 0.1% IGEPAL 的 2x SSC。将其储存在 RT 中。</li>
	<li>使用前，向 99 μL Tris-EDTA 缓冲液中加入 1 μL 蛋白酶 K，新鲜制备蛋白酶 K 消化缓冲液。</li>
	<li>通过将 1 mg DAPI 溶解到 1 mL ddH2O 中来制备 1 mg/mL DAPI 储存原液。将其储存在 -20 °C 且避光。通过将 1 μL 的 DAPI 储存储备液添加到 999 μL 的 2x SSC 溶液中来制备 DAPI 工作溶液。使用前避光保存。</li>
</ol>2. 样品前处理
注：此处使用的载玻片包含标本。
<ol><li>将载玻片在 60-90°C 下老化 20 分钟或过夜（图 1）。 注：此步骤有助于石蜡熔化。通常，加热 20 分钟就足够了。它可以延长到通宵以适应时间表。</li>
	<li>通过将载玻片浸入二甲苯或其替代品中，在 Coplin 罐中 10 分钟来脱蜡。用新鲜的二甲苯或其替代品重复此步骤。在 Coplin 染色缸中执行以下所有预处理和洗涤步骤。 注意：二甲苯替代品是二甲苯的安全环保替代品。其中一种替代品（见 材料表）的性能与二甲苯一样好，甚至更好。虽然二甲苯替代品产生的气味比二甲苯少，但建议在通风橱内使用。如果无法获得二甲苯替代品，则所有程序都与基于二甲苯的脱蜡兼容，无需任何更改。</li>
	<li>用 100% 乙醇洗去二甲苯替代品 5 分钟。</li>
	<li>用 70% 乙醇浸泡玻片再水化 5 分钟。</li>
	<li>将载玻片在 RT 下浸入 0.2 N 盐酸 （HCl） 中 20 分钟。 注：HCl 可有效提取酸溶性蛋白，如碱性核蛋白，以提高 DNA 对 FISH 探针的可及性11。</li>
	<li>将玻片浸入 10 mM 热柠檬酸溶液中，并在 90-95 °C 下孵育 20 分钟。 注：在高温下进行柠檬酸处理同样可提取酸溶性蛋白质。两种酸处理都被认为可以提取细胞外基质蛋白以减少自发荧光12。建议在将柠檬酸溶液应用于玻片之前将其预热至所需的温度范围。微波炉可能是一种方便的方式。水浴，例如使用真空低温烹调器，是高温培养最有效、最经济的解决方案。</li>
	<li>在 2x SSC 中短暂冲洗载玻片以中和 pH 值。</li>
	<li>通过添加 100-200 μL（足以完全覆盖组织，取决于切片的大小）蛋白酶 K 消化缓冲液消化组织，并在室温下孵育 1 分钟。 注：蛋白酶 K 消化进一步增加了 FISH 探针的可及性并减少了自发荧光。消化时间应根据组织类型进行优化。在大多数情况下，1 分钟的消化就足够了。过度消化导致光晕状细胞核形态，应减少消化时间。</li>
	<li>立即停止蛋白酶 K 消化，将载玻片浸入 70% 乙醇中 2 分钟，然后分别进行 85% 和 100% 乙醇处理 2 分钟，使载玻片脱水。</li>
</ol>3. FISH 和成像
<ol><li>用 8 μL 杂交缓冲液稀释 2 μL FISH 探针原液，制备 FISH 杂交混合物，然后将其涂在载玻片上。用盖玻片盖住样品。 注：使用的总 FISH 探针原液范围为 0.5-4 μL，具体取决于图像质量。如果信号太低，请增加探头输入。如果背景太高，请减少 FISH 探针的输入，尤其是当观察到细胞核外的荧光碎片时。杂交缓冲液可以是市售探针随附的杂交缓冲液，也可以是第 1 节中制备的杂交缓冲液。</li>
	<li>将载玻片放在热板上，例如载玻片护城河杂交系统，使 DNA 在 75 °C 下变性 2-5 分钟。然后，将载玻片转移到另一个设置为 37 °C 的热板上以杂交过夜。 注意：如果热板有水盘或储水池以在杂交过程中保持湿度，则无需用橡胶水泥密封盖玻片。</li>
	<li>杂交后，将载玻片浸入 40-60 °C 加热的 0.4x SSC 和 0.3% IGEPAL CA-630 洗涤缓冲液中，然后小心地取下盖玻片。继续洗涤两次，每次在黑暗中洗涤 5 分钟，前 10-15 秒搅拌。 注意：将玻片浸入洗涤缓冲液中有助于轻轻释放盖玻片。</li>
	<li>在黑暗中，在 RT 下用 0.1% IGEPAL CA-630 在 SSC 中洗涤载玻片 5 分钟，搅拌前 10-15 秒。</li>
	<li>为了淬灭自发荧光，使用自发荧光淬灭试剂盒（参见 材料表）处理载玻片，应用 150 μL 试剂（50 μL + 50 μL + 50 μL 试剂 A、B、C）2-5 分钟，然后用 2x SSC 洗涤 5 分钟。 注意：这是一个可选步骤。组织自发荧光主要来源于细胞外基质成分，例如胶原蛋白和弹性蛋白。由于溶酶体和线粒体的脂褐素、NADPH 和黄素辅酶含量，它也受到溶酶体和线粒体的显着影响。醛固定和血细胞的存在也可能很好地增加自发荧光13,14。</li>
	<li>用 DAPI 对载玻片染色 10 分钟。用 2x SSC 缓冲液冲洗载玻片 5 分钟。 注：如果玻片未使用自发荧光淬灭试剂盒处理，则 DAPI 染色可缩短至 2 分钟。</li>
	<li>将玻片快速浸入去离子水中不超过 1 秒，然后用纸巾吸收多余的水分快速干燥。 注意：这是一个可选步骤。去离子水处理可有效防止 SSC 缓冲液在玻片上沉积盐晶，提高成像质量。然而，在这种低离子条件下，FISH 探针和靶向 DNA 之间的氢键被削弱，导致探针解离和信号丢失。因此，在很短的时间内维持水处理步骤至关重要。</li>
	<li>擦干载玻片，然后用抗淬灭封固剂封片。成像前用指甲油密封盖玻片。 注：如果玻片经过自发荧光淬灭试剂处理，请按照制造商的说明使用抗淬灭封固剂封片。此外，根据封固剂的类型，硬化或不硬化，样品必须在密封和成像前固化 1-24 小时。建议样品至少固化过夜，以达到成像的最佳折射率。</li>
	<li>使用 60× 油镜捕获荧光信号。使用 DAPI 通道调整焦点。确保获取多个 Z 堆栈。通常，5-10 个 z 堆栈（间隔为 1 μm）就足够了。执行最大 3D 投影以获得最佳分辨率。应用反卷积或其他背景清除算法以进一步提高图像质量。</li>
</ol>

增强癌症组织样本中致癌驱动因素的 FISH 分析

<ol>
	<li>ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+analysis+of+whole+genomes.">Pan-cancer analysis of whole genomes.</a> Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).</li><li>Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA:+An+emerging+hallmark+in+human+cancer.">Extrachromosomal DNA: An emerging hallmark in human cancer.</a> Annu Rev Pathol. 17, 367-386 (2022).</li><li>Luebeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+in+the+cancerous+transformation+of+Barrett's+oesophagus.">Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett's oesophagus.</a> Nature. 616 (7958), 798-805 (2023).</li><li>Nathanson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+resistance+mediated+by+dynamic+regulation+of+extrachromosomal+mutant+EGFR+DNA.">Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA.</a> Science. 343 (6166), 72-76 (2014).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+is+associated+with+oncogene+amplification+and+poor+outcome+across+multiple+cancers.">Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers.</a> Nat Genet. 52 (9), 891-897 (2020).</li><li>Pal Choudhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+cross-resistance+in+small+cell+lung+cancer+due+to+extrachromosomal+DNA+amplification+of+MYC+paralogs.">Acquired cross-resistance in small cell lung cancer due to extrachromosomal DNA amplification of MYC paralogs.</a> Cancer Discov. 14 (5), 804-827 (2024).</li><li>Greytak, S. R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+molecular+data+generated+with+FFPE+biospecimens:+Lessons+from+the+literature.">Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature.</a> Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).</li><li>Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+in+diagnosis+and+tailored+therapies+in+solid+tumors.">Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors.</a> Molecules. 25 (8), 1864 (2020).</li><li>Cui, C., Shu, W., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+Cell-based+genetic+diagnostic+and+research+applications.">Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 89 (2016).</li><li>Finn, E. H., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+DNA+FISH+protocol+to+visualize+genome+regions+in+human+cells.">A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100741 (2021).</li><li>Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+in+paraffin+tissue+sections.">Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections.</a> Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).</li><li>Richardson, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-fits-all+pretreatment+protocol+facilitating+fluorescence+in+situ+hybridization+on+formalin-fixed+paraffin-embedded,+fresh+frozen+and+cytological+slides.">One-fits-all pretreatment protocol facilitating fluorescence in situ hybridization on formalin-fixed paraffin-embedded, fresh frozen and cytological slides.</a> Mol Cytogenet. 12, 27 (2019).</li><li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications.">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnol Annu Rev. 11, 227-256 (2005).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+diminishing+autofluorescence+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+respiratory+tissue.">Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Liang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin-associated+RNA+dictates+the+ecDNA+interactome+in+the+nucleus.">Chromatin-associated RNA dictates the ecDNA interactome in the nucleus.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Lange, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+dynamics+of+extrachromosomal+DNA+in+human+cancers.">The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers.</a> Nat Genet. 54 (10), 1527-1533 (2022).</li><li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ecDNA+hubs+drive+cooperative+intermolecular+oncogene+expression.">ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression.</a> Nature. 600 (7890), 731-736 (2021).</li><li>Storlazzi, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+amplification+as+double+minutes+or+homogeneously+staining+regions+in+solid+tumors:+origin+and+structure.">Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure.</a> Genome Res. 20 (9), 1198-1206 (2010).</li><li>Guerin, T. M., Marcand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakage+in+breakage-fusion-bridge+cycle:+an+80-year-old+mystery.">Breakage in breakage-fusion-bridge cycle: an 80-year-old mystery.</a> Trends Genet. 38 (7), 641-645 (2022).</li><li>Nguyen, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+mapping+and+accelerated+super-resolution+imaging+of+the+human+genome+using+in+situ+sequencing.">3D mapping and accelerated super-resolution imaging of the human genome using in situ sequencing.</a> Nat Methods. 17 (8), 822-832 (2020).</li><li>Deshpande, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+landscape+of+focal+amplifications+in+cancer+using+AmpliconArchitect.">Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect.</a> Nat Commun. 10 (1), 392 (2019).</li><li>Rajkumar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EcSeg:+Semantic+segmentation+of+metaphase+images+containing+extrachromosomal+DNA.">EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA.</a> iScience. 21, 428-435 (2019).</li></ol>

S.W. 是 Dimension Genomics Inc. 科学顾问委员会的成员。

FISH 是一种快速且经济实惠的细胞遗传学诊断选择。特别是在确定癌症中是否存在 ecDNA 时，FISH 证据仍然是金标准1。FFPE 组织中的 FISH 可以快速确定患者活检标本中的基因状态，从而可以更快地诊断和跟踪整个疾病进展过程中的变化。该技术对于测试已经收集用于病理学的临床样本特别有价值。
该协议涉及几个关键步骤。第一步是彻底脱蜡。残留的石蜡会破坏 FISH 杂交。如果样品在第 2 步后仍然呈蜡状，则应再次用新鲜的二甲苯或其替代品处理。
其次，蛋白质提取和消化至关重要。这些过程不仅增强了 DNA 对 FISH 探针的可及性，还显着减少了自发荧光。该方案包括三个脱蛋白步骤。虽然用 0.2 N HCl 和 10 mM 柠檬酸处理很简单，但蛋白酶 K 消化可能需要优化。过度消化是使用蛋白酶 K 时最常见的错误，导致细胞核呈晕状。缩短消化时间将改善细胞核形态。此外，建议不要同时消解 4 个以上的样品，以尽量减少第一个样品和最后一个样品之间的时间差。需要注意的是，即使是完整的细胞核也可能在高倍率和高分辨率显微镜下表现为光晕。这是因为原子核不在同一焦平面上。因此，建议采用多个 Z 堆栈并执行最大投影来检查核形态。
最后，建议淬灭自发荧光。尽管酸提取和蛋白酶 K 消化可以显著降低蛋白质衍生的背景，但荧光代谢物仍可能影响成像质量。
虽然 FISH 在识别局灶性基因扩增方面提供了无与伦比的空间分辨率，但它也有局限性。首先，与基于 PCR 或下一代测序 （NGS） 的方法相比，含量和通量较低。通常，无需专用设备，即可将 1 到 3 个不同颜色的 FISH 探针应用于单个玻片。尽管如此，自动化技术的进步使高内涵和高通量 FISH（例如 原位 测序21）成为可能。其次，FISH 探针设计需要先验信息。识别癌症中复发性局灶性扩增事件的持续努力使创建用于实验室和临床应用的预设计 FISH panel 成为可能。例如，MYC 家族癌基因在小细胞肺癌中经常被扩增为 ecDNA，以介导化疗耐药性。因此，靶向 MYC 、 MYCL 和 MYCN 基因的 FISH panel 可以加快活检中治疗反应的确定。相比之下，NGS 可以更公正地筛选目标基因。然而，在基于 NGS 的技术中，只有具有计算成本高昂的分析的全基因组测序22 才能表征 ecDNA。
总之，我们为研究 FFPE 样品中的局灶性基因扩增提供了稳健而全面的说明。通过检查 FISH 信号模式，可以明确地清楚基因位点是否以及如何被扩增。我们预计将机器学习集成到间期细胞核的图像分析23 中，以提取有关拷贝数和扩增形式（染色体或 ecDNA）的细胞遗传学信息，从而简化分子诊断过程并增强我们对癌症发病机制的理解。

局灶性癌基因扩增的研究至关重要，因为它会驱动癌症的形成、进展和治疗耐药性 1。重要的是，癌基因和免疫调节基因可能扩增为染色体外 DNA （ecDNA），其不对称遗传促进了癌症的遗传异质性 2,3。ecDNA 与治疗耐药性和不良临床结果有关 4,5,6。
福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织标本是病理学实验室的大量档案资源，为回顾性研究提供了丰富的信息。然而，由于固定过程中的核酸片段化、降解和交联，通过 PCR 或测序从 FFPE 标本中提取分子数据具有挑战性7。在可用于 FFPE 组织分子分析的一系列技术中，荧光 原位 杂交 （FISH） 已被证明可有效显示特定 DNA 序列8。
尽管现代分子诊断技术取得了进步，但 FISH 在单细胞水平上可视化和定量基因扩增的能力为肿瘤发生和临床结果的分子机制提供了有价值的见解。通过使用与目标靶基因互补的荧光标记探针，FISH 可以方便地解析癌基因的定位，并可能推断出单个细胞内癌基因扩增（如 ecDNA）的形式，否则这是不可能的或昂贵的。因此，FISH 提供了一种评估肿瘤异质性和克隆进化的经济方法9。此外，自动化、成像和计算分析的进步促进了 FISH 数据的高通量分析，从而能够对大型组织队列中的基因扩增进行稳健的定量10。
然而，将 FISH 应用于 FFPE 组织存在固有的挑战，包括交联伪影和背景自发荧光。克服这些障碍需要仔细优化每个程序，以确保准确和可重复的结果。本文为应用 FISH 研究 FFPE 组织样品中的基因扩增提供了一个分步、完全优化的方案。使用靶向 ERBB2 （HER2） 基因位点的探针，我们证明 FISH 可以稳健地检测乳腺癌患者 FFPE 样本中的 ERBB2 扩增状态。甚至可以估计 ERBB2 是否被扩增为 ecDNA。通过综合现有文献和我们的实验结果，我们阐明了基于 FISH 的分析的方法学考虑、技术挑战和潜在陷阱。我们还讨论了基因扩增分析在各种癌症类型中的临床相关性，强调了其预后意义和个性化治疗策略的潜力。
综上所述，本文强调了 FISH 作为研究 FFPE 组织标本中基因扩增的宝贵工具的重要性，为肿瘤生物学提供了无与伦比的见解，并指导了肿瘤学的临床决策。随着与互补分子检测的不断完善和整合，基于 FISH 的分析有望进一步增强我们对癌症发病机制的理解，并在精准医学时代改善患者的预后。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>5748</td>
			<td>Nucleus staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate 50% solution</td>
			<td>EMD Millipore Sigma</td>
			<td>S4030</td>
			<td>Probe hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 (HER2) FISH Probe</td>
			<td>Empire Genomics</td>
			<td>ERBB2-20-RE</td>
			<td>FISH probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>Dehydrating and hydrating tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>205821000</td>
			<td>Probe hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formula 83 (Xylene substitute)</td>
			<td>CBG Biotech</td>
			<td>CH0104A</td>
			<td>Removing paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>Sample pretreatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>J19628K2</td>
			<td>Slide washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proclin 300</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>48914-U</td>
			<td>Preservative for SSC buffer (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (800 units/mL)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A (20 mg/mL)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3018L</td>
			<td>Probe hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Moat Hybridization System</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>280001</td>
			<td>Sample denature and hybridization. Alternative hot plates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S2713</td>
			<td>SSC buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>FLBP3271</td>
			<td>SSC buffer and sample pretreatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2473500</td>
			<td>Proteinase K digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td>Probe hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifade mounting media</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>H190010</td>
			<td>Slide mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector TrueVIEW</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SP8400</td>
			<td>Autofluorescence quenching kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust detection of gene amplification in formalin-fixed paraffin-embedded samples by fluorescence in situ hybridization

局灶性基因扩增，如染色体外 DNA （ecDNA），在癌症发展和治疗耐药性中起着重要作用。虽然基于测序的方法能够无偏倚地鉴定 ecDNA，但基于细胞遗传学的技术，如荧光 原 位杂交 （FISH），对于鉴定临床标本中的 ecDNA 来说仍然具有时间和成本效益。FISH 在福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织样本中的应用为检测扩增基因提供了一种独特的途径，特别是当活体样本无法进行核型检查时。然而，这种技术缺乏共识程序。该协议为进行 FISH 检测 FFPE 组织样品中的基因扩增（包括 ecDNA）提供了全面、完全优化的分步说明，这些挑战提出了该协议旨在克服和标准化的独特挑战。通过遵循该协议，研究人员可以可重复地获取高质量的成像数据以评估基因扩增。

The study of focal oncogene amplification is crucial as it drives cancer formation, progression, and therapy resistance1. Importantly, oncogenes and immunoregulatory genes may amplify as extrachromosomal DNAs (ecDNA), whose asymmetric inheritance promotes genetic heterogeneity in cancer2,3. ecDNA has been linked to therapy resistance and unfavorable clinical outcomes4,5,6.
Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens represent a vast archival resource in pathology laboratories, offering abundant information for retrospective studies. However, extracting molecular data from FFPE specimens through PCR or sequencing is challenging due to nucleic acid fragmentation, degradation, and cross-linking during fixation7. Among the array of techniques available for molecular analysis of FFPE tissues, fluorescent in situ hybridization (FISH) has proven effective for visualizing specific DNA sequences8.
Despite the advancement of modern molecular diagnostic techniques, the ability of FISH to visualize and quantify gene amplification at the single-cell level provides valuable insights into the molecular mechanisms underlying tumorigenesis and clinical outcomes. By using fluorescently labeled probes complementary to the target gene of interest, FISH can conveniently resolve the localization of an oncogene and may infer the form of oncogene amplification (such as ecDNA) within individual cells, which is otherwise impossible or expensive through other technologies. Therefore, FISH offers an economical way to assess tumor heterogeneity and clonal evolution9. Furthermore, advances in automation, imaging, and computational analysis have facilitated high-throughput analysis of FISH data, enabling robust quantification of gene amplification across large tissue cohorts10.
However, applying FISH to FFPE tissue presents inherent challenges, including cross-linking artifacts and background autofluorescence. Overcoming these obstacles requires careful optimization of each procedure to ensure accurate and reproducible results. This paper provides a step-by-step, fully optimized protocol for applying FISH to investigate gene amplification in FFPE tissue samples. Using a probe targeting the ERBB2 (HER2) gene locus, we demonstrate that FISH can robustly detect ERBB2 amplification status in FFPE samples from breast cancer patients. It is even possible to estimate whether ERBB2 is amplified as ecDNAs. By synthesizing existing literature and our experimental findings, we elucidate the methodological considerations, technical challenges, and potential pitfalls of FISH-based analysis. We also discuss the clinical relevance of gene amplification profiling in various cancer types, highlighting its prognostic significance and potential for personalized therapeutic strategies.
In summary, this paper underscores the importance of FISH as a valuable tool for studying gene amplification in FFPE tissue specimens, offering unparalleled insights into tumor biology and guiding clinical decision-making in oncology. With continued refinement and integration with complementary molecular assays, FISH-based analysis stands poised to further enhance our understanding of cancer pathogenesis and improve patient outcomes in the era of precision medicine.

作者聚焦：FISH 作为癌症标本中精确基因扩增评估的工具

通过荧光原位杂交对福尔马林固定石蜡包埋样品中的基因扩增进行稳健检测

Oncogene amplification is a critical driver of cancer. Cytogenetic characterization on FFPE samples is a cost-effective way to study oncogene amplification. We present robust and comprehensive instructions for investigating focal gene amplification and FFPE samples.By examining the FISH signal pattern, it becomes unequivocally clear whether and how a gene locus is amplified. Oncogenes amplified as extra chromosomal DNA are found to be prevalent in human cancer, such as lung, breast, and brain cancer. Whole genome sequencing and FISH are the most widely used methods to detect extrachromosomal DNA.Applying FISH to FFPE tissues is challenging because cross-linking artifacts and background autofluorescence often undermine data quality. Our protocol includes optimized procedures, including protein extraction and digestion, heat-denaturing, and autofluorescence quenching techniques to improve data quality during FISH on FFPE samples, which will give valuable insight into cancer progression in patients. We will study the molecular functions of extrachromosomal DNA, and how cancer cells maintain extrachromosomal DNA.Ultimately, we aim to eliminate them to treat cancer.

我们使用来自 HER2 阳性和阴性乳腺癌的 FFPE 样本来证明 FISH 成像的结果。由于 HER2 分子靶向疗法的可用性和有效性，HER2（由 ERBB2 基因编码）的扩增是一个有利的标志物。相反，缺乏 HER2、雌激素受体 （ER） 和孕激素受体 （PR） 表达的三阴性乳腺癌患者由于治疗选择有限而面临不良预后。因此，确定 HER2 状态在乳腺癌研究和治疗中至关重要15。
在三阴性乳腺癌样本中，大多数细胞核显示两个不同的点，代表 HER2/ERBB2 FISH 信号。由于切片偏倚，一些细胞核可能只有一个点（图 2，左）。相比之下，HER2 阳性样本以两种不同的模式呈现丰富的 FISH 信号。一种模式显示整个细胞核中散落的点（图 2，中间）。这种模式是 ecDNA 形态学的一个特征，因为 ecDNA 可能不占据独特且有组织的核区域16。此外，有丝分裂过程中 ecDNA 的不对称分离驱动拷贝数变异，导致细胞核之间的信号异质性17。一些细胞核可能偶尔显示簇，表明 ecDNA 枢纽18 （图 2，右）。另一种类型的 HER2 扩增主要显示棒状、浓缩的聚集体。这种形态可能表明基于染色体的扩增，例如均匀染色区 （HSR）19 或通过断裂-融合桥 （BFB） 循环20。值得注意的是，ecDNA、HSR 和 BFB 扩增可以共存于同一个细胞核中。因此，建议检查多个细胞核以推断局灶性扩增的形式。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig01.jpg"> 图 1：FFPE 样品中 FISH 的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig02.jpg"> 图 2：乳腺癌 FFPE 样本中的代表性 FISH 图像。 放大倍率：600 倍;比例尺：10 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

该方案提供了一种可重复的方法，用于可视化福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织标本中的基因扩增。

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

503 次观看.  University of Texas Southwestern Medical Center. 癌基因扩增是癌症的关键驱动因素。对 FFPE 样品进行细胞遗传学表征是研究癌基因扩增的一种经济高效的方法。我们为研究局灶性基因扩增和 FFPE 样品提供了稳健而全面的说明。通过检查 FISH 信号模式，可以明确地清楚基因位点是否以及如何被扩增。发现作为额外染色体 DNA 扩增的癌基因在人类癌症中普遍存在，例如肺癌、乳腺癌和脑癌。全基?...