S.W.는 텍사스 암 예방 및 연구소(Cancer Prevention and Research Institute of Texas, RR210034)의 학자이며 이 연구소의 지원을 받고 있습니다.

이 연구 프로토콜은 텍사스 대학교 사우스웨스턴 메디컬 센터(University of Texas Southwestern Medical Center)의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 수술 전에 모든 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.
1. 시약 및 재료 준비
<ol><li>0.2 N 염화나트륨 (HCl) 용액을 8.212 mL의 HCl (37 % w / w 또는 12.1 N)를 ddH 491.788 mL의 ddH2O에 천천히 첨가하여 준비합니다. 실온 (RT)에서 보관하십시오. 주의 : 물에 산을 천천히 첨가하십시오. 산에 물을 첨가하지 마십시오.</li>
	<li>10mL의ddH400 O에 Tri-sodium citrate (dihydrate) 1.47g을 용해시켜 2 mM 구연산 용액 (pH 6.0)을 준비합니다. HCl을 사용하여 pH 6.0으로 조정 한 다음 ddH2O를 사용하여 최종 부피를 500mL로 가져옵니다. 버퍼를 RT에 보관합니다.</li>
	<li>100 μL의 Tween-20 내지 900 μL의ddH2O를 첨가하여 10% Tween-20 용액을 제조한다. RT에 보관한다.</li>
	<li>5mL의 IGEPAL CA-630에 45mL의ddH2O를 첨가하여 10% IGEPAL 용액을 준비합니다. RT에 보관합니다.</li>
	<li>ddH2O 900 mL에 구연산삼나트륨(이수화물) 44.1g과 염화나트륨(NaCl) 87.65g을 녹여 2x SSC(pH 7.0, 3M NaCl, 0.3M 구연산나트륨) 용액을 준비합니다. HCl을 사용하여 pH 7.0으로 조정한 다음 ddH2O를 사용하여 최종 부피를 1000mL로 가져옵니다. 완충액을 RT에 보관합니다.</li>
	<li>100mL의 20x SSC를ddH2O의 900mL에 첨가하여 2x SSC 용액을 준비합니다. 필요한 경우 0.5mL의 방부제를 추가합니다(재료 표). RT에 보관하십시오.</li>
	<li>910 μL의 ddH2O, 500 μL의 20x SSC, 50 μL의 10% Tween-20, 40 μL의 RNase A, 1 mL의 50% 덱스트란 설페이트 및 2.5 mL의 포름아미드를 혼합하여 프로브 혼성화 버퍼를 준비합니다. 1mL에 분취하여 -20 °C에서 보관합니다.</li>
	<li>100mL의 2x SSC, 15mL의 10% IGEPAL 및 385mL의ddH2O를 혼합하여 0.4x SSC를 0.3% IGEPAL 용액으로 준비합니다. RT에 보관합니다.</li>
	<li>5mL의 10% IGEPAL 용액 495mL에 2x SSC 용액에 0.1% IGEPAL 용액으로 2x SSC를 준비합니다. RT에 보관하십시오.</li>
	<li>사용하기 전에 1 μL의 Proteinase K를 99 μL의 Tris-EDTA 완충액에 첨가하여 Proteinase K 분해 완충액을 신선하게 준비합니다.</li>
	<li>1mg의 DAPI를 1mL의 ddH2O에 1mg을 용해시켜 DAPI 저장 스톡을 준비합니다. -20 °C에서 빛을 피해 보관하십시오. 1μL의 DAPI 스토리지 스톡을 999μL의 2x SSC 솔루션에 추가하여 DAPI 작업 솔루션을 준비합니다. 사용할 때까지 빛을 피하십시오.</li>
</ol>2. 시료 전처리
알림: 여기에 사용된 슬라이드에는 표본이 포함되어 있습니다.
<ol><li>슬라이드를 60-90°C에서 20분 또는 하룻밤 동안 숙성시킵니다(그림 1). 알림: 이 단계는 파라핀 용융을 용이하게 합니다. 일반적으로 20분의 가열로 충분합니다. 일정에 맞게 하룻밤까지 연장할 수 있습니다.</li>
	<li>슬라이드를 자일렌 또는 그 대체품에 10분 동안 코플린 병에 담가 탈파라핀화합니다. 신선한 크실렌 또는 그 대체품으로 이 단계를 반복합니다. Coplin 항아리에서 다음의 모든 전처리 및 세척 단계를 수행하십시오. 알림: 크실렌 대체품은 자일렌에 대한 안전하고 친환경적인 대안입니다. 대체품 중 하나( 재료 표 참조)는 크실렌만큼 성능이 좋지는 않더라도 성능이 좋습니다. 자일렌 대체품은 자일렌보다 냄새가 적지만 흄 후드 내부에 사용하는 것이 좋습니다. 자일렌 대체품에 접근할 수 없는 경우, 모든 절차는 변경 없이 자일렌 기반 탈파라핀화와 호환됩니다.</li>
	<li>크실렌 대체품을 100% 에탄올로 5분 동안 씻어냅니다.</li>
	<li>70% 에탄올을 5분 동안 담근 슬라이드에 수분을 보충합니다.</li>
	<li>슬라이드를 RT에서 0.2N 염산(HCl)에 20분 동안 담그십시오. 참고: HCl은 염기성 핵 단백질과 같은 산성 단백질을 효과적으로 추출하여 FISH 프로브11에 대한 DNA 접근성을 향상시킵니다.</li>
	<li>슬라이드를 10mM의 뜨거운 구연산 용액에 담그고 90-95°C에서 20분 동안 배양합니다. 참고: 고온에서 구연산 처리는 유사하게 산성 용해성 단백질을 추출합니다. 두 가지 산 처리 모두 세포외 기질 단백질을 추출하여 자가형광을 감소시키는 것으로 생각된다12. 구연산 용액을 슬라이드에 적용하기 전에 원하는 온도 범위로 예열하는 것이 좋습니다. 전자레인지는 그렇게 하는 편리한 방법이 될 수 있습니다. 수비드 쿠커와 같은 수조는 고온 배양을 위한 가장 효과적이고 경제적인 솔루션입니다.</li>
	<li>pH를 중화하기 위해 슬라이드를 2x SSC로 잠시 헹굽니다.</li>
	<li>Proteinase K 분해 완충액 100-200 μL(절편의 크기에 따라 조직을 완전히 덮을 수 있을 만큼)를 추가하여 조직을 분해하고 RT에서 1분 동안 배양합니다. 참고: Proteinase K 분해는 FISH 프로브의 접근성을 더욱 높이고 자가형광을 감소시킵니다. 소화 시간은 조직 유형에 따라 최적화해야 합니다. 대부분의 경우 1분의 소화 시간이면 충분합니다. 과잉 소화는 후광 모양의 핵 형태를 유발하며 분해 시간을 줄여야 합니다.</li>
	<li>Proteinase K 분해를 즉시 중지하고 슬라이드를 70% 에탄올에 2분 동안 담근 다음 85% 및 100% 에탄올을 각각 2분 동안 처리하여 탈수합니다.</li>
</ol>3. 물고기와 이미징
<ol><li>2 μL의 FISH 프로브 스톡을 8 μL의 혼성화 완충액으로 희석하여 FISH 혼성화 혼합물을 준비한 다음 슬라이드에 적용합니다. 커버슬립으로 샘플을 덮습니다. 참고: 사용된 총 FISH 프로브 스톡은 이미지 품질에 따라 0.5-4 μL 범위입니다. 신호가 너무 낮으면 프로브 입력을 늘리십시오. 배경이 너무 높은 경우, 특히 핵 외부의 형광 파편이 관찰되는 경우 FISH 프로브 입력을 줄이십시오. 혼성화 완충액은 상업적으로 구매된 프로브와 함께 제공되거나 섹션 1과 같이 제조된 것일 수 있다.</li>
	<li>슬라이드를 슬라이드 해자 교잡 시스템과 같은 핫 플레이트에 놓고 75°C에서 2-5분 동안 DNA를 변성시킵니다. 그런 다음 슬라이드를 37°C로 설정된 다른 핫 플레이트로 옮겨 밤새 하이브리드화합니다. 알림: 핫 플레이트에 혼성화 중 습도를 유지하기 위해 물통 또는 물통이 있는 경우 고무 시멘트로 커버슬립을 밀봉할 필요가 없습니다.</li>
	<li>하이브리드화 후 슬라이드를 40-60°C로 데워진 0.4x SSC와 0.3% IGEPAL CA-0.30 세척 버퍼에 담근 다음 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다. 처음 5-10초 동안 교반하면서 각각 15분 동안 두 번 세탁을 계속합니다. 알림: 슬라이드를 세탁 버퍼에 담그면 커버슬립을 부드럽게 해제하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>처음 10-15초 동안 교반하면서 어둠 속에서 RT에서 5분 동안 0.1% IGEPAL CA-630으로 SSC에서 슬라이드를 세척합니다.</li>
	<li>자가형광을 소멸시키려면 150μL의 시약(50μL + 50μL + 50μL의 시약 A, B, C)을 2-5분 동안 적용하여 슬라이드를 자가형광 소멸 키트( 재료 표 참조)로 처리한 다음 2x SSC로 5분 동안 세척합니다. 참고: 이 단계는 선택 사항입니다. 조직 자가형광은 주로 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 세포외 기질 구성 요소에서 비롯됩니다. 또한 리소좀과 미토콘드리아의 리포푸신, NADPH, 플라빈 코엔자임 함량에 크게 영향을 받습니다. 알데히드 고정 및 혈액 세포의 존재는 또한 자가형광을 잘 증가시킬 수 있습니다13,14.</li>
	<li>10분 동안 DAPI로 슬라이드를 염색합니다. 2x SSC 버퍼로 슬라이드를 5분 동안 헹굽니다. 참고: 슬라이드가 자가형광 소멸 키트로 처리되지 않으면 DAPI 염색을 2분으로 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>슬라이드를 탈이온수에 1초 이상 담근 다음 종이 타월로 추가 수분을 흡수하여 빠르게 건조시킵니다. 참고: 이 단계는 선택 사항입니다. 탈이온수 처리는 슬라이드에 SSC 완충액의 염 결정 침착을 효과적으로 방지하고 이미징 품질을 향상시킵니다. 그러나 이러한 낮은 이온 조건에서는 FISH 프로브와 표적 DNA 사이의 수소 결합이 약화되어 프로브 해리 및 신호 손실이 발생합니다. 따라서 매우 짧은 시간 동안 수처리 단계를 유지하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>슬라이드를 건조시킨 다음 페이드 방지 장착 미디어로 장착합니다. 이미징하기 전에 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하십시오. 알림: 슬라이드가 자가형광 소멸 시약으로 처리되는 경우 제조업체의 지침에 따라 페이드 방지 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 장착합니다. 또한 장착 매체의 유형, 경화 또는 비경화에 따라 샘플은 밀봉 및 이미징 전에 1-24시간 동안 경화되어야 합니다. 이미징을 위한 최상의 굴절률을 얻기 위해 샘플을 최소한 하룻밤 동안 경화하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>60× oil lens를 사용하여 형광 신호를 캡처합니다. DAPI 채널을 사용하여 포커스를 조정합니다. 여러 Z-스택을 확보해야 합니다. 일반적으로 1μm 간격의 5-10 z 스택으로 충분합니다. 최상의 해상도를 얻기 위해 최대 3D 투영을 수행합니다. 디콘볼루션(deconvolution) 또는 기타 배경 지우기 알고리즘을 적용하여 이미지 품질을 더욱 향상시킬 수 있습니다.</li>
</ol>

암 조직 샘플의 종양 유발 요인에 대한 FISH 분석 개선

<ol>
	<li>ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+analysis+of+whole+genomes.">Pan-cancer analysis of whole genomes.</a> Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).</li><li>Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. 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R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+molecular+data+generated+with+FFPE+biospecimens:+Lessons+from+the+literature.">Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature.</a> Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).</li><li>Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. 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H., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+DNA+FISH+protocol+to+visualize+genome+regions+in+human+cells.">A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100741 (2021).</li><li>Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+in+paraffin+tissue+sections.">Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections.</a> Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).</li><li>Richardson, S. 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S.W.는 Dimension Genomics Inc.의 과학 자문 위원회 위원입니다.

FISH는 세포유전학 진단을 위한 빠르고 저렴한 옵션입니다. 특히 ecDNA가 암에 존재하는지 여부를 결정하는 데 있어서, FISH 증거는 여전히 황금 표준으로 남아 있다1. FFPE 조직의 FISH를 사용하면 환자의 생검 표본에서 유전자 상태를 신속하게 결정할 수 있으므로 질병 진행 전반에 걸쳐 더 빠른 진단과 변화를 추적할 수 있습니다. 이 기술은 병리학을 위해 이미 수집된 임상 샘플을 테스트하는 데 특히 유용합니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 첫 번째 단계는 철저한 탈파라핀화입니다. 잔류 파라핀은 FISH 교잡을 방해할 수 있습니다. 2단계 후에도 샘플이 여전히 왁스처럼 보이면 새 자일렌 또는 그 대체품으로 다시 처리해야 합니다.
둘째, 단백질 추출과 소화가 중요합니다. 이러한 프로세스는 FISH 프로브에 대한 DNA의 접근성을 향상시킬 뿐만 아니라 자동 형광을 크게 줄입니다. 이 프로토콜에는 세 가지 탈단백질화 단계가 포함됩니다. 0.2 N HCl 및 10 mM 구연산을 사용한 처리는 간단하지만 proteinase K 분해는 최적화가 필요할 수 있습니다. 과분해는 proteinase K를 사용할 때 가장 흔한 오류이며, 이로 인해 후광 모양의 핵이 생성됩니다. 분해 시간을 단축하면 핵 형태가 개선됩니다. 또한 첫 번째 샘플과 마지막 샘플 사이의 시간 차이를 최소화하기 위해 4개 이상의 샘플을 동시에 분해하지 않는 것이 좋습니다. 손상되지 않은 핵조차도 고배율 및 고해상도 현미경 검사에서 후광으로 나타날 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이것은 핵이 같은 초점면에 있지 않기 때문입니다. 따라서 핵 형태를 검사하기 위해 여러 Z-stack을 취하고 최대 투영을 수행하는 것이 좋습니다.
마지막으로, 자가형광 소멸이 권장됩니다. 산 추출 및 proteinase K 분해는 단백질 유래 배경을 크게 줄일 수 있지만 형광 대사 산물은 여전히 이미징 품질에 영향을 미칠 수 있습니다.
FISH는 초점 유전자 증폭을 식별하는 데 있어 비교할 수 없는 공간 해상도를 제공하지만 한계가 있습니다. 첫째, PCR 또는 차세대 염기서열분석(NGS) 기반 접근법에 비해 함량과 처리량이 낮습니다. 전형적으로, 다른 색깔의 1개에서 3개의 FISH 탐침은 특별한 장비 없이 단 하나 활주에 적용될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 자동화 기술의 발전으로 in situ sequencing21과 같은 고함량 및 고처리량 FISH가 실현 가능해졌습니다. 둘째, FISH 프로브 설계에는 사전 정보가 필요합니다. 암에서 재발성 국소 증폭 사건을 식별하기 위한 지속적인 노력을 통해 실험실 및 임상 응용 분야를 위해 사전 설계된 FISH 패널을 만들 수 있었습니다. 예를 들어, MYC 계열 종양 유전자는 소세포 폐암에서 화학 요법 내성을 중재하기 위해 ecDNA로 자주 증폭됩니다. 따라서 MYC, MYCL 및 MYCN 유전자를 표적으로 하는 FISH 패널은 생검에서 치료 반응을 신속하게 결정할 수 있습니다. 이에 비해 NGS는 관심 유전자를 보다 편향 없이 스크리닝할 수 있습니다. 그러나 NGS 기반 기술 중에서는 계산 비용이 많이 드는 분석(22 )을 이용한 전체 게놈 염기서열 분석만이 ecDNA를 특성화할 수 있습니다.
요약하면, FFPE 샘플에서 초점 유전자 증폭을 조사하기 위한 강력하고 포괄적인 지침을 제시합니다. FISH 신호 패턴을 검사하면 유전자 자리가 증폭되는지 여부와 증폭 방법을 명확하게 알 수 있습니다. 우리는 기계 학습을 간기 핵의 이미지 분석(23 )에 통합하여 복제 수 및 증폭 형태(염색체 또는 ecDNA)에 관한 세포유전학적 정보를 추출함으로써 분자 진단 프로세스를 간소화하고 암의 발병 메커니즘에 대한 이해를 높일 것으로 기대합니다.

국소 종양유전자 증폭에 대한 연구는 암 형성, 진행 및 치료 저항성을 촉진하기 때문에 매우 중요합니다1. 중요한 것은 종양 유전자와 면역 조절 유전자가 염색체 외 DNA(ecDNA)로 증폭될 수 있으며, 이들의 비대칭 유전은 암에서 유전적 이질성을 촉진합니다 2,3. ecDNA는 치료 내성 및 바람직하지 않은 임상 결과와 관련이 있습니다 4,5,6.
포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 표본은 병리학 실험실의 방대한 보관 자료로, 후향적 연구를 위한 풍부한 정보를 제공합니다. 그러나 PCR 또는 염기서열분석을 통해 FFPE 표본에서 분자 데이터를 추출하는 것은 핵산 단편화, 분해 및 고정 중 교차 결합으로 인해 어렵습니다7. FFPE 조직의 분자 분석에 사용할 수 있는 다양한 기법 중에서 형광 현장 혼성화(FISH)는 특정 DNA 염기서열을 시각화하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다8.
현대 분자 진단 기술의 발전에도 불구하고 단일 세포 수준에서 유전자 증폭을 시각화하고 정량화하는 FISH의 능력은 종양 형성 및 임상 결과의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. FISH는 관심 대상 유전자를 보완하는 형광 표지 프로브를 사용하여 종양 유전자의 국소화를 편리하게 해결할 수 있으며 다른 기술로는 불가능하거나 비용이 많이 드는 개별 세포 내 종양 유전자 증폭 형태(예: ecDNA)를 추론할 수 있습니다. 따라서 FISH는 종양 이질성 및 클론 진화를 평가할 수 있는 경제적인 방법을 제공한다9. 또한 자동화, 이미징 및 컴퓨터 분석의 발전으로 FISH 데이터의 고처리량 분석이 용이해졌으며, 이를 통해 대규모 조직 코호트에서 유전자 증폭을 강력하게 정량화할 수 있게 되었습니다10.
그러나 FISH를 FFPE 조직에 적용하는 것은 교차 결합 아티팩트 및 배경 자가형광을 포함한 본질적인 문제를 제시합니다. 이러한 장애물을 극복하려면 정확하고 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 각 절차를 신중하게 최적화해야 합니다. 이 논문은 FFPE 조직 샘플에서 유전자 증폭을 조사하기 위해 FISH를 적용하기 위한 단계별로 완전히 최적화된 프로토콜을 제공합니다. ERBB2(HER2) 유전자 위치를 표적으로 하는 프로브를 사용하여 FISH가 유방암 환자의 FFPE 샘플에서 ERBB2 증폭 상태를 강력하게 검출할 수 있음을 입증합니다. ERBB2가 ecDNA로 증폭되는지 여부를 추정하는 것도 가능합니다. 기존 문헌과 실험 결과를 종합하여 FISH 기반 분석의 방법론적 고려 사항, 기술적 과제 및 잠재적 위험을 설명합니다. 또한 다양한 암 유형에서 유전자 증폭 프로파일링의 임상적 관련성에 대해 논의하고 예후의 중요성과 맞춤형 치료 전략에 대한 잠재력을 강조합니다.
요약하면, 이 논문은 FFPE 조직 표본에서 유전자 증폭을 연구하기 위한 귀중한 도구로서 FISH의 중요성을 강조하고, 종양 생물학에 대한 탁월한 통찰력을 제공하고 종양학의 임상 의사 결정을 안내합니다. 보완 분자 분석과의 지속적인 개선 및 통합을 통해 FISH 기반 분석은 정밀 의학 시대에 암 발병 기전에 대한 이해를 더욱 높이고 환자 결과를 개선할 준비가 되어 있습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>5748</td>
			<td>Nucleus staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate 50% solution</td>
			<td>EMD Millipore Sigma</td>
			<td>S4030</td>
			<td>Probe hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 (HER2) FISH Probe</td>
			<td>Empire Genomics</td>
			<td>ERBB2-20-RE</td>
			<td>FISH probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2716</td>
			<td>Dehydrating and hydrating tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>205821000</td>
			<td>Probe hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formula 83 (Xylene substitute)</td>
			<td>CBG Biotech</td>
			<td>CH0104A</td>
			<td>Removing paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>Sample pretreatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>J19628K2</td>
			<td>Slide washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proclin 300</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>48914-U</td>
			<td>Preservative for SSC buffer (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (800 units/mL)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A (20 mg/mL)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T3018L</td>
			<td>Probe hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Moat Hybridization System</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>280001</td>
			<td>Sample denature and hybridization. Alternative hot plates are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S2713</td>
			<td>SSC buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>FLBP3271</td>
			<td>SSC buffer and sample pretreatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2473500</td>
			<td>Proteinase K digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td>Probe hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifade mounting media</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>H190010</td>
			<td>Slide mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector TrueVIEW</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>SP8400</td>
			<td>Autofluorescence quenching kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust detection of gene amplification in formalin-fixed paraffin-embedded samples by fluorescence in situ hybridization

염색체 외 DNA(ecDNA)와 같은 국소 유전자 증폭은 암 발병 및 치료 내성에 중요한 역할을 합니다. 염기서열분석 기반 방법론을 사용하면 ecDNA를 편향되지 않게 식별할 수 있지만, FISH(Fluorescence in situ hybridization)와 같은 세포유전학 기반 기법은 임상 검체에서 ecDNA를 식별하는 데 시간과 비용 효율성을 유지합니다. 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 샘플에 FISH를 적용하면 특히 핵형 검사에 생존 가능한 샘플을 사용할 수 없는 경우 증폭된 유전자를 검출할 수 있는 고유한 방법을 제공합니다. 그러나 이 기술에 대한 합의 절차가 부족합니다. 이 프로토콜은 이 프로토콜이 극복하고 표준화하는 것을 목표로 하는 고유한 문제를 제시하는 FFPE 조직 샘플에서 ecDNA를 포함한 유전자 증폭을 검출하기 위해 FISH를 수행하기 위한 포괄적이고 완전히 최적화된 단계별 지침을 제공합니다. 이 프로토콜을 따름으로써 연구자들은 유전자 증폭을 평가하기 위한 고품질 이미징 데이터를 재현성 있게 획득할 수 있습니다.

The study of focal oncogene amplification is crucial as it drives cancer formation, progression, and therapy resistance1. Importantly, oncogenes and immunoregulatory genes may amplify as extrachromosomal DNAs (ecDNA), whose asymmetric inheritance promotes genetic heterogeneity in cancer2,3. ecDNA has been linked to therapy resistance and unfavorable clinical outcomes4,5,6.
Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens represent a vast archival resource in pathology laboratories, offering abundant information for retrospective studies. However, extracting molecular data from FFPE specimens through PCR or sequencing is challenging due to nucleic acid fragmentation, degradation, and cross-linking during fixation7. Among the array of techniques available for molecular analysis of FFPE tissues, fluorescent in situ hybridization (FISH) has proven effective for visualizing specific DNA sequences8.
Despite the advancement of modern molecular diagnostic techniques, the ability of FISH to visualize and quantify gene amplification at the single-cell level provides valuable insights into the molecular mechanisms underlying tumorigenesis and clinical outcomes. By using fluorescently labeled probes complementary to the target gene of interest, FISH can conveniently resolve the localization of an oncogene and may infer the form of oncogene amplification (such as ecDNA) within individual cells, which is otherwise impossible or expensive through other technologies. Therefore, FISH offers an economical way to assess tumor heterogeneity and clonal evolution9. Furthermore, advances in automation, imaging, and computational analysis have facilitated high-throughput analysis of FISH data, enabling robust quantification of gene amplification across large tissue cohorts10.
However, applying FISH to FFPE tissue presents inherent challenges, including cross-linking artifacts and background autofluorescence. Overcoming these obstacles requires careful optimization of each procedure to ensure accurate and reproducible results. This paper provides a step-by-step, fully optimized protocol for applying FISH to investigate gene amplification in FFPE tissue samples. Using a probe targeting the ERBB2 (HER2) gene locus, we demonstrate that FISH can robustly detect ERBB2 amplification status in FFPE samples from breast cancer patients. It is even possible to estimate whether ERBB2 is amplified as ecDNAs. By synthesizing existing literature and our experimental findings, we elucidate the methodological considerations, technical challenges, and potential pitfalls of FISH-based analysis. We also discuss the clinical relevance of gene amplification profiling in various cancer types, highlighting its prognostic significance and potential for personalized therapeutic strategies.
In summary, this paper underscores the importance of FISH as a valuable tool for studying gene amplification in FFPE tissue specimens, offering unparalleled insights into tumor biology and guiding clinical decision-making in oncology. With continued refinement and integration with complementary molecular assays, FISH-based analysis stands poised to further enhance our understanding of cancer pathogenesis and improve patient outcomes in the era of precision medicine.

저자 스포트라이트: 암 표본에서 정확한 유전자 증폭 평가를 위한 도구로서의 FISH

Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

Oncogene amplification is a critical driver of cancer. Cytogenetic characterization on FFPE samples is a cost-effective way to study oncogene amplification. We present robust and comprehensive instructions for investigating focal gene amplification and FFPE samples.By examining the FISH signal pattern, it becomes unequivocally clear whether and how a gene locus is amplified. Oncogenes amplified as extra chromosomal DNA are found to be prevalent in human cancer, such as lung, breast, and brain cancer. Whole genome sequencing and FISH are the most widely used methods to detect extrachromosomal DNA.Applying FISH to FFPE tissues is challenging because cross-linking artifacts and background autofluorescence often undermine data quality. Our protocol includes optimized procedures, including protein extraction and digestion, heat-denaturing, and autofluorescence quenching techniques to improve data quality during FISH on FFPE samples, which will give valuable insight into cancer progression in patients. We will study the molecular functions of extrachromosomal DNA, and how cancer cells maintain extrachromosomal DNA.Ultimately, we aim to eliminate them to treat cancer.

HER2 양성 및 음성 유방암 모두의 FFPE 샘플을 사용하여 FISH 이미징 결과를 입증했습니다. HER2 ( ERBB2 유전자에 의해 암호화됨)의 증폭은 HER2 분자 표적 요법의 가용성과 효과로 인해 유리한 마커입니다. 반대로 HER2, 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR)의 발현이 부족한 삼중음성 유방암 환자는 치료 옵션이 제한되어 있어 결과가 좋지 않습니다. 따라서 HER2 상태를 결정하는 것은 유방암 연구 및 치료에 매우 중요하다15.
삼중 음성 유방암 샘플에서 대부분의 핵은 HER2/ERBB2 FISH 신호를 나타내는 두 개의 뚜렷한 점을 표시합니다. 일부 핵은 절편 편향으로 인해 점이 하나만 있을 수 있습니다(그림 2, 왼쪽). 대조적으로, HER2 양성 샘플은 두 가지 다른 패턴을 가진 풍부한 FISH 신호를 나타냅니다. 한 패턴은 핵 전체에 흩어져 있는 점들을 보여줍니다(그림 2, 가운데). 이 패턴은 ecDNA 형태학의 특징인데, ecDNA는 독특하고 조직화된 핵 영역을 차지하지 않을 수 있기때문이다(16). 또한, 유사분열 중 ecDNA의 비대칭 분리는 복제 수 변동을 유도하여핵 17 간의 신호 이질성을 유발합니다. 일부 핵은 ecDNA 허브(18 )를 나타내는 가끔 클러스터를 보일 수 있다(그림 2, 오른쪽). 다른 유형의 HER2 증폭은 주로 막대 모양의 응축된 응집체를 표시합니다. 이 형태는 균질하게 염색되는 영역(HSR)19 또는 파손-융합-브리지(BFB) 사이클(20)을 통한 염색체 기반 증폭을 나타낼 수 있습니다. 특히, ecDNA, HSR 및 BFB 증폭은 동일한 핵에서 공존할 수 있습니다. 따라서 focal amplification의 형태를 추론하기 위해 여러 핵을 검사하는 것이 좋습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig01.jpg"> 그림 1: FFPE 샘플의 FISH에 대한 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig02.jpg"> 그림 2: 유방암 FFPE 샘플의 대표적인 FISH 이미지. 배율 : 600x; 눈금 막대: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 표본에서 유전자 증폭을 시각화하는 재현 가능한 방법을 제공합니다.

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

robust-detection-gene-amplification-formalin-fixed-paraffin-embedded

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

525 조회수.  University of Texas Southwestern Medical Center. 종양유전자 증폭은 암을 유발하는 중요한 요인입니다. FFPE 샘플의 세포유전학적 특성 분석은 종양유전자 증폭을 연구하는 비용 효율적인 방법입니다. 당사는 국소 유전자 증폭 및 FFPE 샘플을 조사하기 위한 강력하고 포괄적인 지침을 제공합니다.FISH 신호 패턴을 검사하면 유전자 자리가 증폭되는지 여부와 증폭 방법을 명확하게 알 수 있습니다...