通过渗透调节诱导 Bursaphelenchus xylophilus 的第三阶段扩散幼鱼进入隐生

我们的研究主要集中在松木线虫第三阶段幼虫扩散的受冷机制上，特别是解决松木线虫如何承受大约零下 20 度的低温胁迫。目前的实验挑战是脱水时间，这对于确定 Bursaphelenchus xylophilus 第三阶段分散幼鱼的存活率至关重要。我们建议时间越长，强调越好。

我们已经确定，Bursaphelenchus xylophilus 的第三阶段分散幼鱼进入隐生状态使它们能够承受极端低温环境，突出了恶劣条件下的关键生存机制。我们的方案通过在松木线虫中诱导隐生并成功地在结构上恢复它们来解决研究空白。它支持对其生存机制和其他应用的对照研究。

我们的协议简单可靠，为承受松木线虫的抗逆机制提供了非常强大的技术支持，与其他技术相比，使其更易于访问和高效。首先用锯子将收集的马尾松圆木切成 0.5 至 1 厘米厚的切片。将切片修剪成 2 到 3 厘米长的小条。

将小木条放入密封袋中，并将袋子存放在实验室中以备将来使用。将橡胶管连接到直径约为 15 厘米的长颈玻璃漏斗的窄端。用夹管固定橡胶管，然后将组装好的漏斗放在漏斗架上。

将小木条完全包裹在单层薄纸中。将包裹好的木条放入漏斗中，加入蒸馏水，直到所有木条都浸没，然后慢慢松开漏斗底部的夹管，让 2000 至 5， 000 微升的混合物泄漏到直径为 5 厘米的培养皿中，用于显微镜检查和形态学鉴定。观察混合物以通过注意探针、食管正中球、脂滴和手指状尾巴形状等特征来识别 J3 Bursaphelenchus xylophilus。

使用 10 微升移液器，每次吸出 10 微升液体和一只线虫，将单个 J3 Bursaphelenchus xylophilus 转移到载玻片上。最后，在提取 J3 Bursaphelenchus xylophilus 后，对剩余的木条和受感染的木质材料进行消毒，以防止进一步污染。首先，从马尾松中提取 J3 Bursaphelenchus xylophilus 的标本，然后制备 8% 氯化钾水溶液用于渗透调节。

使用移液管，将 10 微升 8% 氯化钾水溶液添加到含有 J3 Bursaphelenchus xylophilus 混合物的载玻片中。将载玻片放在显微镜载物台上，让水自然蒸发。在显微镜下观察 J3 Bursaphelenchus xylophilus 的脱水过程。

监测身体卷曲和聚集等体征。当水完全蒸发并且氯化钾晶体沉淀时，观察线虫停止移动并进入隐生。将隐生植物 J3 Bursaphelenchus xylophilus 置于零下 20 摄氏度的恒温环境中 24 小时。

24 小时后，使用移液管在接受低温处理的幼鱼周围加入大约 300 微升蒸馏水。在显微镜下观察 J3 Bursaphelenchus xylophilus 的再水化过程。监测身体伸展和恢复运动等体征。