Наши исследования в первую очередь сосредоточены на холодовосприимчивых механизмах рассеивания молоди третьей стадии сосновой лесной нематоды, в частности, на том, как сосновая древесная нематода выдерживает низкотемпературный стресс при температуре около минус 20. В настоящее время экспериментальной проблемой является время обезвоживания, которое имеет решающее значение для определения выживаемости молоди Bursaphelenchus xylophilus на третьей стадии расселения. Мы советуем, что чем дольше время, тем лучше акцент.
Установлено, что попадание в криптобиоз молоди Bursaphelenchus xylophilus третьей стадии рассеивания позволяет им выдерживать экстремально низкие температуры, что является ключевым механизмом выживания в суровых условиях. Наш протокол восполняет пробел в исследованиях, вызывая криптобиоз у сосновых древесных нематод и успешно возрождая их архитектурно. Это позволяет проводить контролируемые исследования механизмов их выживания и применять их в других целях.
Наш протокол прост и надежен для очень надежной технической поддержки устойчивых механизмов устойчивости к напряжениям кедровой древесной нематоды, что делает его более доступным и эффективным по сравнению с другими методами. Начните с того, что распилите собранные круглые бревна Pinus massoniana на ломтики толщиной от 0,5 до одного сантиметра с помощью пилы. Нарежьте ломтики небольшими полосками по два-три сантиметра в длину.
Поместите небольшие деревянные полоски в герметичные пакеты и храните пакеты в лаборатории для дальнейшего использования. Приложите резиновую трубку к узкому концу стеклянной воронки с длинным горлышком диаметром примерно 15 сантиметров. Закрепите резиновую трубку щипковым краном и поместите собранную воронку на подставку для воронки.
Полностью оберните небольшие деревянные полоски в один слой папиросной бумаги. Поместите обернутые деревянные полосы в воронку и добавьте дистиллированную воду до тех пор, пока все деревянные полосы не будут погружены в воду, затем медленно отпустите щипков на дне воронки и дайте от 2000 до 5000 микролитров смеси просочиться в чашку Петри диаметром пять сантиметров для микроскопического исследования и морфологической идентификации. Понаблюдайте за смесью, чтобы идентифицировать J3 Bursaphelenchus xylophilus, обратив внимание на такие особенности, как стилеты, срединные луковицы пищевода, липидные капли и пальцеобразные формы хвоста.
Используя пипетку объемом 10 микролитров, каждый раз отсасывайте 10 микролитров жидкости вместе с одной нематодой, чтобы перенести отдельного J3 Bursaphelenchus xylophilus на предметное стекло. Наконец, стерилизуйте оставшиеся древесные полосы и зараженные древесные материалы после извлечения J3 Bursaphelenchus xylophilus, чтобы предотвратить дальнейшее загрязнение. Для начала извлеките образцы J3 Bursaphelenchus xylophilus из Pinus massoniana, затем приготовьте 8%-ный водный раствор хлорида калия для осмотической регуляции.
С помощью пипетки добавьте 10 микролитров 8%-ного водного раствора хлорида калия в предметное стекло, содержащее смесь J3 Bursaphelenchus xylophilus. Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа и дайте воде испариться естественным образом. Понаблюдайте за процессом обезвоживания J3 Bursaphelenchus xylophilus под микроскопом.
Следите за такими признаками, как скручивание тела и агрегация. Когда вода полностью испарится и кристаллы хлорида калия выпадут в осадок, наблюдайте, как нематоды прекращают движение и входят в криптобиоз. Поместите криптобиотика J3 Bursaphelenchus xylophilus в среду постоянной температуры минус 20 градусов Цельсия на 24 часа.
Через 24 часа с помощью пипетки добавьте примерно 300 микролитров дистиллированной воды вокруг молодых особей, подвергшихся низкотемпературной обработке. Понаблюдайте за процессом регидратации J3 Bursaphelenchus xylophilus под микроскопом. Следите за такими признаками, как растяжение тела и возобновление движения.
