Unsere Forschung konzentriert sich hauptsächlich auf die kälterezeptiven Mechanismen der Ausbreitung von Jungtieren im dritten Stadium des Kiefernfadenwurms, insbesondere darauf, wie der Kiefernfadenwurm einem niedrigen Temperaturstress von etwa minus 20 Grad standhält. Die aktuelle experimentelle Herausforderung ist die Dehydratationszeit, die für die Bestimmung der Überlebensrate von Jungtieren von Bursaphelenchus xylophilus im dritten Stadium entscheidend ist. Wir empfehlen, je länger die Zeit, desto besser die Betonung.
Wir haben festgestellt, dass der Eintritt von Jungtieren aus der Ausbreitung im dritten Stadium von Bursaphelenchus xylophilus in die Kryptobiose es ihnen ermöglicht, extremen Umgebungen mit niedrigen Temperaturen standzuhalten, was einen wichtigen Überlebensmechanismus unter rauen Bedingungen unterstreicht. Unser Protokoll schließt die Forschungslücke, indem es Kryptobiose in Kiefernholznematoden induziert und sie erfolgreich architektonisch wiederbelebt. Es ermöglicht kontrollierte Studien ihrer Überlebensmechanismen und zusätzliche Anwendungen.
Unser Protokoll ist einfach und zuverlässig und bietet eine sehr robuste technische Unterstützung, um den Stressresistenzmechanismen des Kiefernholznematoden standzuhalten, was es im Vergleich zu anderen Techniken zugänglicher und effizienter macht. Schneiden Sie zunächst die gesammelten Rundstämme von Pinus massoniana mit einer Säge in 0,5 bis einen Zentimeter dicke Scheiben. Schneiden Sie die Scheiben in kleine Streifen von zwei bis drei Zentimetern Länge.
Legen Sie die kleinen Holzstreifen in versiegelte Beutel und bewahren Sie die Beutel zur weiteren Verwendung in einem Labor auf. Befestigen Sie einen Gummischlauch am schmalen Ende eines langhalsigen Glastrichters mit einem ungefähren Durchmesser von 15 Zentimetern. Befestigen Sie den Gummischlauch mit einem Quetschhahn und stellen Sie den zusammengebauten Trichter auf einen Trichterständer.
Wickeln Sie die kleinen Holzstreifen vollständig in eine einzige Schicht Seidenpapier ein. Legen Sie die eingewickelten Holzstreifen in den Trichter und fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, bis alle Holzstreifen untergetaucht sind, lassen Sie dann langsam den Quetschhahn am Boden des Trichters los und lassen Sie 2000 bis 5.000 Mikroliter der Mischung in eine Petrischale mit einem Durchmesser von fünf Zentimetern auslaufen, um sie mikroskopisch zu untersuchen und morphologisch zu identifizieren. Beobachte die Mischung, um J3 Bursaphelenchus xylophilus zu identifizieren, indem du Merkmale wie Stilette, mediane Ösophagusknollen, Lipidtröpfchen und fingerähnliche Schwanzformen notierst.
Mit einer 10-Mikroliter-Pipette aspirieren Sie jeweils 10 Mikroliter Flüssigkeit zusammen mit einem Fadenwurm, um einzelne J3 Bursaphelenchus xylophilus auf einen Objektträger zu übertragen. Sterilisieren Sie abschließend die verbleibenden Holzstreifen und infizierten Holzmaterialien nach der Extraktion von J3 Bursaphelenchus xylophilus, um eine weitere Kontamination zu verhindern. Extrahieren Sie zunächst Proben von J3 Bursaphelenchus xylophilus aus Pinus massoniana und bereiten Sie dann eine wässrige Lösung mit 8 % Kaliumchlorid für die osmotische Regulation vor.
Geben Sie mit einer Pipette 10 Mikroliter der 8%igen wässrigen Kaliumchloridlösung in den Objektträger, der die Mischung von J3 Bursaphelenchus xylophilus enthält. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und lassen Sie das Wasser auf natürliche Weise verdunsten. Beobachten Sie den Dehydratisierungsprozess von J3 Bursaphelenchus xylophilus unter dem Mikroskop.
Überwachen Sie Anzeichen wie Körperkrümmungen und Aggregationen. Wenn das Wasser vollständig verdunstet ist und Kaliumchloridkristalle ausfallen, beobachten Sie, wie die Nematoden ihre Bewegung stoppen und in die Kryptobiose eintreten. Setzen Sie das Kryptobiotikum J3 Bursaphelenchus xylophilus 24 Stunden lang in eine Umgebung mit konstanter Temperatur von minus 20 Grad Celsius.
Nach 24 Stunden geben Sie mit einer Pipette etwa 300 Mikroliter destilliertes Wasser um die Jungtiere, die einer Niedertemperaturbehandlung unterzogen wurden. Beobachten Sie den Rehydratationsprozess von J3 Bursaphelenchus xylophilus unter dem Mikroskop. Achte auf Anzeichen wie Körperdehnung und die Wiederaufnahme der Bewegung.
