Nossa pesquisa se concentra principalmente nos mecanismos de receptividade ao frio dos juvenis de terceiro estágio de dispersão do nematóide da madeira do pinheiro, abordando especificamente como o nematóide da madeira do pinheiro resiste ao estresse de baixa temperatura em aproximadamente 20 graus negativos. O desafio experimental atual é o tempo de desidratação, que é crítico para determinar a taxa de sobrevivência de juvenis de dispersão de terceiro estágio de Bursaphelenchus xylophilus. Aconselhamos que quanto maior o tempo, melhor a ênfase.
Estabelecemos que a entrada de juvenis de dispersão de terceiro estágio de Bursaphelenchus xylophilus na criptobiose permite que eles resistam a ambientes de temperatura extremamente baixa, destacando um mecanismo chave de sobrevivência em condições adversas. Nosso protocolo aborda a lacuna de pesquisa induzindo criptobiose em nematóides da madeira de pinheiro e revivendo-os arquitetonicamente com sucesso. Permite estudos controlados de seus mecanismos de sobrevivência e aplicações adicionais.
Nosso protocolo é simples e confiável para suporte técnico muito robusto para suportar os mecanismos de resistência ao estresse do nematóide da madeira de pinheiro, tornando-o mais acessível e eficiente em comparação com outras técnicas. Comece cortando as toras redondas coletadas de Pinus massoniana em fatias medindo 0,5 a um centímetro de espessura usando uma serra. Apare as fatias em pequenas tiras de dois a três centímetros de comprimento.
Coloque as pequenas tiras de madeira em sacos selados e guarde-os em um laboratório para uso posterior. Prenda um tubo de borracha na extremidade estreita de um funil de vidro de gargalo longo com um diâmetro aproximado de 15 centímetros. Prenda o tubo de borracha com uma torneira e coloque o funil montado em um suporte de funil.
Embrulhe completamente as pequenas tiras de madeira em uma única camada de papel de seda. Coloque as tiras de madeira embrulhadas no funil e adicione água destilada até que todas as tiras de madeira estejam submersas, depois solte lentamente a torneira no fundo do funil e deixe vazar de 2000 a 5.000 microlitros da mistura para uma placa de Petri de cinco centímetros de diâmetro para exame microscópico e identificação morfológica. Observe a mistura para identificar J3 Bursaphelenchus xylophilus, observando características como estiletes, bulbos esofágicos medianos, gotículas lipídicas e formas de cauda semelhantes a dedos.
Usando uma pipeta de 10 microlitros, aspire 10 microlitros de líquido junto com um nematóide de cada vez para transferir J3 Bursaphelenchus xylophilus individual para uma lâmina. Finalmente, esterilize as tiras de madeira restantes e os materiais de madeira infectados após a extração de J3 Bursaphelenchus xylophilus para evitar mais contaminação. Para começar, extraia amostras de J3 Bursaphelenchus xylophilus de Pinus massoniana e, em seguida, prepare uma solução aquosa de cloreto de potássio a 8% para regulação osmótica.
Usando uma pipeta, adicione 10 microlitros da solução aquosa de cloreto de potássio a 8% na lâmina contendo a mistura de J3 Bursaphelenchus xylophilus. Coloque a lâmina no microscópio stage e deixe a água evaporar naturalmente. Observe o processo de desidratação de J3 Bursaphelenchus xylophilus ao microscópio.
Monitore sinais como ondulação e agregação corporal. Quando a água evaporar completamente e os cristais de cloreto de potássio precipitarem, observe os nematóides parando de se mover e entrando na criptobiose. Coloque o criptobiótico J3 Bursaphelenchus xylophilus em um ambiente de temperatura constante de menos 20 graus Celsius por 24 horas.
Após 24 horas, use uma pipeta para adicionar aproximadamente 300 microlitros de água destilada ao redor dos juvenis que foram submetidos ao tratamento de baixa temperatura. Observe o processo de reidratação de J3 Bursaphelenchus xylophilus ao microscópio. Monitore sinais como alongamento do corpo e retomada do movimento.
