המחקר שלנו מתמקד בעיקר במנגנוני קליטת הקור של צעירי השלב השלישי של נמטודות עץ אורן, ומתייחס במיוחד לאופן שבו נמטודת עץ האורן עומדת בלחץ בטמפרטורה נמוכה בערך במינוס 20. האתגר הניסויי הנוכחי הוא זמן התייבשות, שהוא קריטי בקביעת שיעור ההישרדות של צעירים בשלב השלישי של Bursaphelenchus xylophilus. אנו ממליצים שככל שהזמן ארוך יותר, כך הדגש טוב יותר.
קבענו כי כניסתם של צעירי פיזור שלב שלישי של Bursaphelenchus xylophilus לקריפטוביוזיס מאפשרת להם לעמוד בסביבות טמפרטורות נמוכות קיצוניות, ומדגישה מנגנון הישרדות מרכזי בתנאים קשים. הפרוטוקול שלנו מטפל בפער המחקרי על ידי השראת קריפטוביוזיס בנמטודות מעץ אורן והחייאתן בהצלחה מבחינה ארכיטקטונית. הוא מאפשר מחקרים מבוקרים של מנגנוני ההישרדות שלהם ויישומים נוספים.
הפרוטוקול שלנו פשוט ואמין לתמיכה טכנית חזקה מאוד לעמידה במנגנוני עמידות בפני מתח של נמטודות עץ אורן, מה שהופך אותו לנגיש ויעיל יותר בהשוואה לטכניקות אחרות. התחל בחיתוך בולי העץ העגולים שנאספו של Pinus massoniana לפרוסות בעובי של 0.5 עד סנטימטר אחד בעזרת מסור. חותכים את הפרוסות לרצועות קטנות באורך של שניים עד שלושה סנטימטרים.
מניחים את רצועות העץ הקטנות בשקיות אטומות ומאחסנים את השקיות במעבדה לשימוש נוסף. חבר צינור גומי לקצה הצר של משפך זכוכית ארוך צוואר בקוטר משוער של 15 סנטימטרים. אבטח את צינור הגומי בעזרת פינצ'קוק והנח את המשפך המורכב על מעמד משפך.
עטפו לחלוטין את רצועות העץ הקטנות בשכבה אחת של נייר טישו. מניחים את רצועות העץ העטופות במשפך ומוסיפים מים מזוקקים עד שכל רצועות העץ שקועות, ואז משחררים לאט את הפינצ'קוק בתחתית המשפך ומאפשרים ל-2000 עד 5,000 מיקרוליטר מהתערובת לדלוף לצלחת פטרי בקוטר חמישה סנטימטרים לבדיקה מיקרוסקופית וזיהוי מורפולוגי. התבונן בתערובת כדי לזהות J3 Bursaphelenchus xylophilus על ידי ציון תכונות כגון סגנונות, נורות הוושט החציוניות, טיפות שומן וצורות זנב דמויות אצבע.
בעזרת פיפטה של 10 מיקרוליטר, שאבו 10 מיקרוליטר נוזל יחד עם נמטודה אחת בכל פעם כדי להעביר J3 Bursaphelenchus xylophilus בודד לשקופית. לבסוף, יש לעקר את רצועות העץ הנותרות וחומרי העץ הנגועים לאחר חילוץ J3 Bursaphelenchus xylophilus כדי למנוע זיהום נוסף. כדי להתחיל, חלץ דגימות של J3 Bursaphelenchus xylophilus מ-Pinus massoniana, ולאחר מכן הכין תמיסה מימית של 8% אשלגן כלורי לוויסות אוסמוטי.
בעזרת פיפטה מוסיפים 10 מיקרוליטר מהתמיסה המימית של 8% אשלגן כלורי לשקופית המכילה את התערובת של J3 Bursaphelenchus xylophilus. הנח את השקופית על במת המיקרוסקופ ואפשר למים להתאדות באופן טבעי. התבונן בתהליך ההתייבשות של J3 Bursaphelenchus xylophilus תחת המיקרוסקופ.
עקוב אחר סימנים כגון סלסול גוף וצבירה. כאשר המים מתאדים במלואם וגבישי אשלגן כלורי משקעים, התבוננו בנמטודות שעוצרות את התנועה ונכנסות לקריפטוביוזיס. הנח את הקריפטוביוטיקה J3 Bursaphelenchus xylophilus בסביבת טמפרטורה קבועה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
לאחר 24 שעות, השתמש בפיפטה כדי להוסיף כ-300 מיקרוליטר מים מזוקקים סביב הצעירים שעברו טיפול בטמפרטורה נמוכה. התבונן בתהליך ההתייבשות של J3 Bursaphelenchus xylophilus תחת המיקרוסקופ. עקוב אחר סימנים כגון מתיחת הגוף וחידוש התנועה.
