우리의 연구는 주로 소나무 선충의 분산 3단계 유충의 추위 수용 메커니즘에 초점을 맞추고 있으며, 특히 소나무 선충이 약 영하 20도의 저온 스트레스를 견디는 방법을 다룹니다. 현재 실험적 과제는 탈수 시간이며, 이는 Bursaphelenchus xylophilus의 3기 분산 유년기의 생존율을 결정하는 데 중요합니다. 시간이 길수록 강조가 좋아지는 것이 좋습니다.
우리는 Bursaphelenchus xylophilus의 3기 분산 유년기가 크립토바이오시스에 진입하면 극한의 저온 환경을 견딜 수 있음을 확인했으며, 이는 가혹한 조건에서 중요한 생존 메커니즘을 강조합니다. 우리의 프로토콜은 소나무 선충에서 cryptobiosis를 유도하고 구조적으로 성공적으로 부활시킴으로써 연구 격차를 해소합니다. 이를 통해 생존 메커니즘과 추가 응용 분야에 대한 통제된 연구를 수행할 수 있습니다.
당사의 프로토콜은 소나무 선충의 응력 저항 메커니즘을 견디기 위한 매우 강력한 기술 지원을 위해 간단하고 신뢰할 수 있어 다른 기술에 비해 더 접근하기 쉽고 효율적입니다. 톱을 사용하여 수집된 Pinus massoniana의 둥근 통나무를 두께가 0.5-1cm인 조각으로 자르는 것으로 시작합니다. 조각을 2-3cm 길이의 작은 조각으로 자릅니다.
작은 나무 조각을 밀봉된 가방에 넣고 나중에 사용할 수 있도록 가방을 실험실에 보관하십시오. 직경이 약 15cm인 긴 목 유리 깔때기의 좁은 끝에 고무 튜브를 부착합니다. 핀치콕으로 고무 튜브를 고정하고 조립된 깔때기를 깔때기 스탠드에 놓습니다.
작은 나무 조각을 한 겹의 티슈 페이퍼로 완전히 감쌉니다. 포장된 나무 조각을 깔때기에 넣고 모든 나무 조각이 잠길 때까지 증류수를 첨가한 다음 깔때기 바닥에 있는 핀치콕을 천천히 풀고 혼합물의 2000-5, 000 마이크로리터가 현미경 검사 및 형태학적 식별을 위해 5cm 직경의 페트리 접시로 누출되도록 합니다. 혼합물을 관찰하여 J3 Bursaphelenchus xylophilus를 식별하려면 탐침, 중간 식도구, 지질 방울 및 손가락 모양의 꼬리 모양과 같은 특징에 주목합니다.
10마이크로리터 피펫을 사용하여 매번 10마이크로리터의 액체와 선충 1개를 흡입하여 개별 J3 Bursaphelenchus xylophilus를 슬라이드로 옮깁니다. 마지막으로, J3 Bursaphelenchus xylophilus를 추출한 후 남아 있는 목재 스트립과 감염된 목재 재료를 살균하여 추가 오염을 방지합니다. 시작하려면 Pinus massoniana에서 J3 Bursaphelenchus xylophilus 표본을 추출한 다음 삼투압 조절을 위한 8% 염화칼륨 수용액을 준비합니다.
피펫을 사용하여 10 마이크로 리터의 8 % 염화칼륨 수용액을 J3 Bursaphelenchus xylophilus의 혼합물이 들어있는 슬라이드에 추가합니다. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 물이 자연적으로 증발하도록 합니다. 현미경으로 J3 Bursaphelenchus xylophilus의 탈수 과정을 관찰하십시오.
몸 컬링 및 응집과 같은 징후를 모니터링합니다. 물이 완전히 증발하고 염화칼륨 결정이 침전되면 선충이 움직임을 멈추고 크립토바이오시스(cryptobiosis)로 들어가는 것을 관찰합니다. 크립토바이오틱스 J3 Bursaphelenchus xylophilus를 섭씨 영하 20도의 일정한 온도 환경에 24시간 동안 놓습니다.
24시간 후, 피펫을 사용하여 저온 처리를 받은 어린 동물 주위에 약 300마이크로리터의 증류수를 추가합니다. 현미경으로 J3 Bursaphelenchus xylophilus의 재수화 과정을 관찰합니다. 신체 스트레칭 및 움직임 재개와 같은 징후를 모니터링합니다.
