Induzione dell'ingresso di giovani in dispersione al terzo stadio di Bursaphelenchus xylophilus nella criptobiosi attraverso la regolazione osmotica

La nostra ricerca si concentra principalmente sui meccanismi ricettivi al freddo dei giovani di dispersione al terzo stadio del nematode del pino, affrontando in particolare il modo in cui il nematode del pino resiste allo stress a bassa temperatura a circa meno 20. L'attuale sfida sperimentale è il tempo di disidratazione, che è fondamentale per determinare il tasso di sopravvivenza dei giovani in dispersione al terzo stadio di Bursaphelenchus xylophilus. Consigliamo che più lungo è il tempo, maggiore è l'enfasi.

Abbiamo stabilito che l'ingresso di giovani di dispersione al terzo stadio di Bursaphelenchus xylophilus nella criptobiosi consente loro di resistere ad ambienti a temperature estremamente basse, evidenziando un meccanismo chiave di sopravvivenza in condizioni difficili. Il nostro protocollo affronta la lacuna della ricerca inducendo la criptobiosi nei nematodi del pino e rivitalizzandoli con successo dal punto di vista architettonico. Consente studi controllati dei loro meccanismi di sopravvivenza e ulteriori applicazioni.

Il nostro protocollo è semplice e affidabile per un supporto tecnico molto robusto per resistere ai meccanismi di resistenza alle sollecitazioni del nematode del pino, rendendolo più accessibile ed efficiente rispetto ad altre tecniche. Inizia tagliando i tronchi rotondi raccolti di Pinus massoniana in fette di spessore compreso tra 0,5 e un centimetro con una sega. Tagliate le fette a listarelle di due o tre centimetri di lunghezza.

Metti le piccole strisce di legno in sacchetti sigillati e conservali in un laboratorio per un ulteriore utilizzo. Attacca un tubo di gomma all'estremità stretta di un imbuto di vetro a collo lungo con un diametro di circa 15 centimetri. Fissare il tubo di gomma con un rubinetto e posizionare l'imbuto assemblato su un supporto per imbuto.

Avvolgere completamente le piccole strisce di legno in un unico strato di carta velina. Posizionare le strisce di legno avvolte nell'imbuto e aggiungere acqua distillata fino a quando tutte le strisce di legno sono sommerse, quindi rilasciare lentamente il rubinetto sul fondo dell'imbuto e lasciare che da 2000 a 5.000 microlitri della miscela fuoriescano in una capsula di Petri di cinque centimetri di diametro per l'esame microscopico e l'identificazione morfologica. Osservare la miscela per identificare J3 Bursaphelenchus xylophilus notando caratteristiche come stiletti, bulbi esofagei mediani, goccioline lipidiche e forme della coda simili a dita.

Utilizzando una pipetta da 10 microlitri, aspirare ogni volta 10 microlitri di liquido insieme a un nematode per trasferire il singolo J3 Bursaphelenchus xylophilus su un vetrino. Infine, sterilizzare le strisce di legno rimanenti e i materiali legnosi infetti dopo aver estratto J3 Bursaphelenchus xylophilus per prevenire ulteriori contaminazioni. Per iniziare, estrarre campioni di J3 Bursaphelenchus xylophilus da Pinus massoniana, quindi preparare una soluzione acquosa di cloruro di potassio all'8% per la regolazione osmotica.

Utilizzando una pipetta, aggiungere 10 microlitri della soluzione acquosa di cloruro di potassio all'8% al vetrino contenente la miscela di J3 Bursaphelenchus xylophilus. Posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio e lasciare che l'acqua evapori naturalmente. Osservare al microscopio il processo di disidratazione di J3 Bursaphelenchus xylophilus.

Monitora segni come l'arricciamento e l'aggregazione del corpo. Quando l'acqua evapora completamente e i cristalli di cloruro di potassio precipitano, osservare i nematodi che smettono di muoversi ed entrano in criptobiosi. Posizionare il criptobiotico J3 Bursaphelenchus xylophilus in un ambiente a temperatura costante di meno 20 gradi Celsius per 24 ore.

Dopo 24 ore, utilizzare una pipetta per aggiungere circa 300 microlitri di acqua distillata intorno ai giovani che hanno subito un trattamento a bassa temperatura. Osservare al microscopio il processo di reidratazione di J3 Bursaphelenchus xylophilus. Monitorare segni come lo stiramento del corpo e la ripresa del movimento.