Araştırmamız öncelikle, çam ağacı nematodunun dağılan üçüncü aşama yavrularının soğuğa alıcı mekanizmalarına odaklanmakta ve özellikle çam ağacı nematodunun yaklaşık eksi 20'de düşük sıcaklık stresine nasıl dayandığını ele almaktadır. Mevcut deneysel zorluk, Bursaphelenchus xylophilus'un üçüncü evre dağılma juvenillerinin hayatta kalma oranını belirlemede kritik olan dehidrasyon süresidir. Süre ne kadar uzun olursa, vurgunun o kadar iyi olmasını tavsiye ederiz.
Bursaphelenchus xylophilus'un üçüncü aşama dağılış yavrularının kriptobiyoza girmesinin, aşırı düşük sıcaklıktaki ortamlara dayanmalarını sağladığını ve zorlu koşullarda önemli bir hayatta kalma mekanizmasını vurguladığını belirledik. Protokolümüz, çam ağacı nematodlarında kriptobiyozu indükleyerek ve bunları mimari olarak başarılı bir şekilde canlandırarak araştırma boşluğunu ele almaktadır. Hayatta kalma mekanizmalarının kontrollü çalışmalarını ve ek uygulamaları mümkün kılar.
Protokolümüz, çam ağacı nematodunun strese dayanıklılık mekanizmalarını ayakta tutmak için çok sağlam teknik destek için basit ve güvenilirdir, bu da onu diğer tekniklere kıyasla daha erişilebilir ve verimli hale getirir. Pinus massoniana'nın toplanan yuvarlak kütüklerini bir testere kullanarak 0,5 ila bir santimetre kalınlığında dilimler halinde keserek başlayın. Dilimleri iki ila üç santimetre uzunluğunda küçük şeritler halinde kesin.
Küçük ahşap şeritleri kapalı torbalara yerleştirin ve daha sonra kullanmak üzere torbaları bir laboratuvarda saklayın. Yaklaşık 15 santimetre çapında uzun boyunlu bir cam huninin dar ucuna lastik bir tüp takın. Kauçuk boruyu bir kıstırma musluğu ile sabitleyin ve monte edilmiş huniyi bir huni standına yerleştirin.
Küçük ahşap şeritleri tek bir kağıt mendil tabakasına tamamen sarın. Sarılmış ahşap şeritleri huniye yerleştirin ve tüm ahşap şeritler suya batırılana kadar damıtılmış su ekleyin, ardından huninin altındaki kıstırma musluğunu yavaşça serbest bırakın ve karışımın 2000 ila 5.000 mikrolitresinin mikroskobik inceleme ve morfolojik tanımlama için beş santimetre çapında bir Petri kabına sızmasına izin verin. Stileler, medyan özofagus ampulleri, lipit damlacıkları ve parmak benzeri kuyruk şekilleri gibi özelliklere dikkat ederek J3 Bursaphelenchus xylophilus'u tanımlamak için karışımı gözlemleyin.
10 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, tek tek J3 Bursaphelenchus xylophilus'u bir slayta aktarmak için her seferinde bir nematod ile birlikte 10 mikrolitre sıvıyı aspire edin. Son olarak, daha fazla kontaminasyonu önlemek için J3 Bursaphelenchus xylophilus'u çıkardıktan sonra kalan ahşap şeritleri ve enfekte ahşap malzemeleri sterilize edin. Başlamak için, Pinus massoniana'dan J3 Bursaphelenchus xylophilus örneklerini çıkarın, ardından ozmotik düzenleme için %8'lik bir potasyum klorür sulu çözeltisi hazırlayın.
Bir pipet kullanarak, J3 Bursaphelenchus xylophilus karışımını içeren slayta 10 mikrolitre% 8 potasyum klorür sulu çözeltisi ekleyin. Slaytı mikroskop tablasına yerleştirin ve suyun doğal olarak buharlaşmasına izin verin. J3 Bursaphelenchus xylophilus'un dehidrasyon sürecini mikroskop altında gözlemleyin.
Vücut kıvrılma ve toplanma gibi işaretleri izleyin. Su tamamen buharlaştığında ve potasyum klorür kristalleri çökeldiğinde, nematodların hareketi durdurduğunu ve kriptobiyoza girdiğini gözlemleyin. Kriptobiyotik J3 Bursaphelenchus xylophilus'u 24 saat boyunca eksi 20 santigrat derece sabit sıcaklıktaki bir ortama yerleştirin.
24 saat sonra, düşük sıcaklıkta işlem gören yavruların etrafına yaklaşık 300 mikrolitre damıtılmış su eklemek için bir pipet kullanın. J3 Bursaphelenchus xylophilus'un rehidrasyon sürecini mikroskop altında gözlemleyin. Vücudun gerilmesi ve hareketin yeniden başlaması gibi işaretleri izleyin.
