Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Zusammenfassung

PI (4,5) P ₂ regelt verschiedene Zellfunktionen, aber die nanoskaligen Organisation in der Zellplasmamembran ist wenig bekannt. Durch Markierung PI (4,5) P ₂ mit einer zweifarbige Fluoreszenzsonde zur Domäne Pleckstrin Homology fusioniert beschreiben wir einen neuen Ansatz der PI (4,5) P ₂ in der räumlichen Verteilung der Plasmamembran im Nanometerbereich zu studieren .

Zusammenfassung

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P₂) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P₂ in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P₂ in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

Einleitung

Phosphoinositiden tragen zu einem geringen Teil der gesamten Membranlipiden, sondern in einer Vielzahl von zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielen. Sie umfassen sieben Mitglieder abgeleitet von reversible Phosphorylierung oder Dephosphorylierung des inositol Ringe auf der ^{3., 4.} und ^5. Positionen ^1. Phosphatidylinositol - 4-phosphat (PI4P) und Phosphatidylinositol - 4,5-bisphosphat (PI (4,5) P ₂₎ sind zwei wichtige Phosphoinositiden , die relativ unabhängig wie die Determinante Lipide der Zellplasmamembran (PM) ^2,3 funktionieren. Phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP ₃₎ viel weniger reichlich als PI4P und PI (4,5) P _2, aber es hat einzigartige Funktionen in verschiedenen zellulären Prozessen , einschließlich Krebs und Diabetes ^{4 5.} Diese Lipide haben komplexe molekulare Interaktionen mit ihren Effektoren und viele andere Proteine. Daher ist es entscheidend, die räumliche Organisation dieser pho zu verstehensphoinositides im PM auf der Nanometer-Skala.

Montage Beweise hat gezeigt , dass Proteinkomplexe oder Molekülcluster in den engen PM Bereichen als Signal Hotspots ⁶ dienen kann. Zum Beispiel Syntaxin 1a, ein Schlüsselprotein , das die Membranfusion ^7-9, zeigt Cluster - Organisation in der PM reguliert. Unterscheidet sich von der Konsensusansicht der Clusterorganisation von Syntaxin 1a, die räumliche Verteilung von Phosphoinositiden in der PM ist umstritten. PI (4,5) P ₂ Verteilungsmuster reichen von Uniform ^10-12, große Flecken ^13,14, zu dichten Büscheln ^14-18, je nach Zelltypen und experimentelle Methoden verwendet. Die räumliche Organisation von PI (4,5) P ₂ mit höherer Auflösung ist auch widersprüchlich. Eine Studie unter Verwendung von stimulierten Emission-Depletion (STED) Mikroskopie ¹⁹ hat eine große Anzahl von dicht PI (4,5) P ₂ Nanocluster (~ 73 nm Durchmesser) in den PM Blätter PC-12 - Zellen ²⁰ ergab . Dieses Ergebnis unterscheidet sich von Studien unter Verwendung von Schnellfroster Elektronenmikroskopie (EM) ^21,22, ein Ansatz, der die intakte PM Struktur von lebenden Zellen viel besser als chemische Fixierung bewahrt. Diese zeigten einen deutlichen Pools von PI (4,5) P _2; relativ konzentrierten PI (4,5) P ₂ in Caveolae und beschichtet sowie eine gleichmäßige Verteilung auf der flachen Region PM Pits. Darüber hinaus nanoskaligen PI (4,5) P ₂ Organisation in Membranfolien können in lebenden und fixierten Zellen unterscheiden. Unsere jüngsten Arbeiten untersucht dieses Problem in stationären und leben INS-1 - Zellen Einzelmolekül - Lokalisationsmikroskopie (SMLM) ²³ verwendet wird .

SMLM basiert auf stochastisch Einschalten nur eine kleine Teilmenge von Fluorophoren zu einem bestimmten Zeitpunkt, so dass einzelne Fluorophore mit hoher Genauigkeit lokalisiert werden. Viele Super-Resolution Imaging-Ansätze wurden unter Verwendung ähnlicher Prinzipien entwickelt, um die Beugungsgrenze der konventionellen Lichtmikroskopie zu überwinden, wie eins Photoaktivierungslokalisationsmikroskopie (PALM) ^24, Fluoreszenzphotoaktivierungslokalisationsmikroskopie (FPALM) ^25, stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) ^26,27 und direkte STORM (dSTORM) ^28. Mit photoschaltbare oder photoaktivierbaren Fluorophore (Farbstoffe oder fluoreszierende Proteine), erlauben SMLM Techniken Wissenschaftler Bild biologischen Strukturen in Nanometer - Auflösung ^24,29,30 mit Video-Rate in lebenden Zellen ^31,32.

Mit PI (4,5) P ₂ als Beispiel, haben wir das SMLM Ansatz die nanoskalige Verteilung von Phosphoinositid auf dem PM zu studieren. Die PH - Domäne von PLCδ1 (Phospholipase C δ1) , die PI bindet spezifisch an (4,5) P ₂ eine gut etablierte Sonde zur Bildgebung PI (4,5) P ₂ subzelluläre Verteilung und Dynamik ^33,34 in der PM . Wir haben genetisch diese Domäne mit zwei fluoreszierenden Proteinen markiert, PAmCherry1 ³⁵ und ³⁶ iRFP , um eine Zweifarben - Fusionsprotein (iRFP-PAmCherry1-PH _{PLCδ1) (1A-B).} PAmCherry1 dient als photoaktivierbare Sonde von PH - Domäne für PALM und iRFP dient als allgemeiner Indikator zu transfizierten Zellen zu identifizieren , bevor PALM Erwerb . Wir wenden diese zweifarbige Fluoreszenzsonde für SMLM Bildgebung in den festen Membranfolien. Für Live - PALM - Bildgebung, getaggt wir mEOS3 ³⁷ anstelle von PAmCherry1 an die PH _PLCδ1 Domäne der mEOS3.1-PH _PLCδ1 Sonde für seine bessere Photoneneffizienz und Helligkeit (1C-D) zu erzeugen.

SMLM Bildgebung mit dieser neuartigen Sonden in der PM von insulinsezernierenden INS-1 - Zellen ³⁸ hat homogene Markierung von PI (4,5) P ₂ in der Mehrzahl der PM Regionen sowie konzentrierte PI (4,5) P ₂ freigelegt Mikrodomänen , die in der Wohnung PM und einige Filopodien artige Strukturen ²³ dünn miteinander vermischt werden. Dann einnoScale Verteilung von PI (4,5) P ₂ eine strukturelle Basis für ein Umdenken , wie es funktioniert in lebenden Zellen.

Protokoll

1. Membranblatt Vorbereitung und Fixierung

1. Bereiten Membranblätter markiert mit iRFP-PAmCherry1-PH _{PLC δ1}
   1. Bereiten Sie die DNA - Plasmid - Codierung iRFP-PAmCherry1-PH _PLC ²³ molekularen Standardbiologische Techniken mit _{& dgr; 1.}
   2. Kultur INS-1 - Zellen auf # 1.5 18 mm runden Deck vorbeschichtet mit 30 ug / ml Fibronektin zu 50-70% Konfluenz folgenden Standard INS-1 - Zellkulturprotokolle ^38,39. Transfizieren einen Tag, um die Zellen nach 50 bis 70% Konfluenz erreicht ist.
   3. Transfizieren Zellen mit iRFP-PAmCherry1-PH _{PLC & dgr; 1} der Protokolle folgenden Hersteller Liposom Transfektionsreagenz verwenden. Nach der Transfektion erlauben, die Zellen für 48 Stunden wachsen.
   4. Am Tag des Experiments coat Deckgläser (auf einer Seite) mit ~ 0,5-1 ml von 500 ug / ml Poly-D-Lysine; für 1-2 h (PDL in dH ₂ O verdünnt). Dann PDL Drain durch ein Tissue-Papier Platzierung aufder Rand des Deckglases. Platzieren Sie die Deckgläser auf einem vorgekühlten (4 ° C) Metallplatte zur späteren Verwendung.
   5. Waschen vorge transfizierten INS-1-Zellen wachsen auf Deckgläser mit ~ 0,5-1 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 1 mM EGTA. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal und Drain-PBS.
   6. Platzieren Sie die Deckgläser mit kultivierten Zellen (cell-Seite nach unten) auf den PDL-beschichtete Deckgläser auf einem vorgekühlten Metallplatte mit einer Pinzette. Verlassen , um die Platte in einem Kühlschrank (4 ° C) für 7 bis 10 min Zellen zu ermöglichen, den PDL-beschichtete Deckgläser (Abbildung 2) zu befestigen.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit in dem Bereich von 7 sein sollte - 10 min für eine bessere Befestigung der Zellen an der PDL-beschichteten Oberfläche. Der Kühlschrank Umgebung ist trocken und Inkubation sollte nicht zu lang sein.
   7. Entfernen Sie die Metallplatte aus dem Kühlschrank. schälen Sie vorsichtig das Deckglas die Pre-transfizierten Zellen mit einer Pinzette enthält. Dies erzeugt eine dünne Schicht der Zellmembran Blatt auf derPDL-beschichtete Deckglas. Waschen Sie sich leicht die Membranblätter mit ~ 0,5-1 ml eiskaltem PBS und dann fix mit ~ 0,5-1 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) + 0,2% Glutaraldehyd (GA) in PBS für 15 min bei 4 ° C.
      Achtung: Paraformaldehyd und Glutaraldehyd sind giftig. Behandeln Sie sie in einem Abzug mit der Haut und Augenschutz.
   8. 1 ml PBS bei 4 ° C - Nach der Fixierung Bild sofort die Membranfolien oder lagern in ~ 0.5 (siehe Abschnitt 3).
      HINWEIS: Nachdem das Membranblatt Fixierung, wird es kein Gleichgewicht sein Bindung von pH - Sonden von Cytosol PI (4,5) _P2. Die gebundenen pH-Sonden werden nach und nach aus dem Membranblatt dissoziieren und diffundieren in die Lösung (obwohl es Tage bis Wochen dauern kann). Daher ist es die festen Proben direkt nach der Probenvorbereitung auf Bild empfohlen.
2. Bereiten Membranblätter für PI (4,5) P ₂ - spezifische Antikörper - Markierung
   1. Kultur INS-1-Zellen auf # 1.5, 18 mm rund Deck vorbeschichtet mit 30 &# 181; g / ml Fibronektin zu 50% -70% Konfluenz. Transfizieren Zellen mit Plasmid-DNA, am nächsten Tag als 1.1.3 in Schritt beschrieben.
   2. Wiederholen Sie die Schritte von 1.1.4 bis 1.1.7, wie oben beschrieben.
      ANMERKUNG: Führen Sie die folgenden Verfahren, bei 4 ° C.
   3. Waschen Sie die Deckgläser befestigt PM Blätter enthält , dreimal mit ~ 0,5 bis 1 ml eiskaltem PBS 50 mM NH ₄ Cl enthält. Quenche die Blätter mit ~ 0,5-1 ml 0,1% Natriumborhydrid in PBS für 7 min, und wasche mit ~ 0,5-1 ml PBS (ohne 50 mM NH ₄ Cl).
   4. Blockieren der Proben mit ~ 0,5-1 ml Blockierungslösung (PBS - Lösung , enthaltend 5% (v / v) normales Ziegenserum, 5% (v / v) Rinderserumalbumin und 50 mM NH ₄ Cl) für 45 min. Dann inkubieren mit ~ 0,5-1 ml primären PI (4,5) P ₂ - Antikörper (1: 300 Verdünnung) in Lösung für 1 h blockiert. Waschen dreimal (je 10 min) mit ~ 0,5-1 ml PBS 50 mM NH ₄ Cl enthält.
   5. Inkubieren Proben mit ~ 0,5-1 ml Sekundär F (ab ') 2-Ziege-Anti-MausAntikörper mit Fluorophoren konjugiert (1: 300) Puffer für 1 h bei der Blockierung. Waschen dreimal mit ~ 0,5-1 ml PBS.
   6. Postfix-Proben mit 4% PFA + 0.2% GA für 15 min, dann waschen Proben dreimal mit PBS (7 min jedesmal). Fahren Sie mit Abschnitt 3 für die Bildgebung oder lagern in ~ 0.5 ~ 1 ml PBS bei 4 ° C für die spätere Verwendung.
      HINWEIS: Bereiten Proben bei 4 ° C. Verwenden Sie 4% PFA + 0,2% GA Fixiermittel die physiologische Verteilung von Phosphoinositid in der PM zu erhalten. RT Vorbereitung oder Fixierung mit 4% PFA allein kann erhebliche Artefakte (Abbildung 4).

2. Zellkultur Vorbereitung für das Live-Cell - Imaging mit mEOS3.1-PH _{PLC δ1}

1. Bereiten Sie die DNA - Plasmid , das die mEOS3.1-PH _{PLC δ1} wie zuvor ²³ _beschrieben.
2. Kultur INS-1-Zellen auf # 1.5 18 mm runden Deckgläschen vorbeschichtet mit 30 ug / ml Fibronektin, bis sie erreichen 50% -70% confluency folgende Standard - INS-1 - Zellkulturprotokolle ^38,39.
3. Am folgenden Tag, transfizieren INS-1 - Zellen mit dem mEOS3.1-PH _{PLC & dgr; 1} - DNA - Plasmid - Liposom - Transfektionsreagenz unter Verwendung des Protokolls nach der Herstellung. Inkubieren für 48 Stunden vor der Bildgebung.

3. PALM Image Acquisition von Membranblätter und lebenden Zellen

1. PALM Bildaufnahme von Membranfolien
   HINWEIS: Hier wird eine interne Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) Mikroskop auf Basis SMLM System (100X Öl, APO, NA = 1,49, WD 0,12 mm) ²³ wird für alle Bildaufnahme verwendet.
   1. Vor Bildgebung, verdünnen 1 ul fluoreszierenden Beadlösung in 10 ml PBS + 50 mM MgCl _2. In 200 ul verdünnte Lösung in die Abbildungskammer enthält, Zellproben (aus den Schritten 1.1.8 / 1.2.6) für 10 min. Dann waschen mit PBS dreimal.
   2. Starten Sie das PALM-Bildgebungssystem. In der zugehörigen Imaging-Software, wählen Sie den "iRFP Kanal &# 34; Taste (642 nm Laseranregung, 700/75 nm-Emission). Finden Sie die Zellmembran PH Sonden im iRFP Kanal exprimieren.
      HINWEIS: Die Membranfolie eine fluoreszierende Perle in der Nähe haben. Dies wird später für Driftkorrektur erforderlich.
   3. Verwenden Sie die "Aufnahme" Taste ein herkömmliches TIRF Bild von der Zellmembran in iRFP Kanal als Referenz für zukünftige Bildrekonstruktion zu sammeln. Stellen Sie einen normalen TIRF Winkel (dh nach den kritischen Winkel erreichen, biegen Sie weitere 1,5 Grad) von in 2140 in den TIRF Winkel Eingabe für die Bildgebung zu setzen. Verwenden Sie diesen Winkel für alle Schritte einstellen, sofern nicht anders vermerkt.
      HINWEIS: In der TIRF hier beschriebenen System 3500 ist die vertikale up Winkel, 2200 ist der TIRF kritische Winkel, und 2140 ist der normale TIRF Winkel, der 1,5 Grad mehr nach TIRF kritische Winkel. Der schmale TIRF Winkel unten erwähnt in 3.2.3 ist 2120, das ist ein weiterer 2 Grad nach TIRF kritischen Winkel erreicht.
   4. Wechseln Sie in den PAmCherry1 Kanal durch th klickene RFP Kanaltaste (561 nm Anregung, 600/50 nm Emissionsfilter). Stellen Sie die Bildlaufleiste in der "AOTF" pad den ganzen Weg auf der rechten Seite für 10-20 sec volle Leistung Beleuchtung von 561-nm-Laser zu haben, um die Hintergrund Membran Fluoreszenz bleichen.
   5. Stellen Sie die optimale Kameraeinstellung (2x2 Binning) im Register "Format" und die schnelle Akquisitionsprotokoll in "ND Sequenzerfassung" Register (typischerweise 10.000-40.000 Bilder bei 20 Hz).
   6. Starten Sie Erwerb von PAmCherry1 Bilder (561-nm-Laser bei voller Leistung, 50 ms / Frame) bei gleichzeitiger 405 nm Laseraktivierung auf einem niedrigen Niveau (0,1% - 1%), indem Sie auf den "Jetzt ausführen" klicken. Passen Sie die Intensität von 405 nm Laser, so dass räumlich getrennt einzelne Punkte in jedem Frame leicht identifizierbar sind.
      HINWEIS: Die Anzahl der aktivierbaren PAmCherry1 Moleküle nimmt allmählich während der Erfassung. 405 nm Laserintensität allmählich erhöht werden sollte, um die optimale Dichte der einzelnen Molekül Signale in jedem zu haltenRahmen.
   7. Weiter Bilder zu erwerben, bis kein PAmCherry1 einzelnes Molekül Signal aktiviert wird.
2. PALM-Bildgebung in lebenden Zellen
   1. Vor der Bebilderung, verdünntem fluoreszierenden Kügelchen in die Abbildungskammer für 10 min, wie in Schritt 3.1.1 beschrieben. PALM Bildgebung durch Öffnen der zugehörigen Imaging-Software Starten Sie dann.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine magnetische Schnellspann Imaging-Kammer für Live-Cell-Imaging. Aufrechterhaltung der Mitte des Abbildungsfeldes bei 35 ° C mit einem Temperaturregler unter konstanter Perfusion mit extrazellulären Puffer (extrazelluläre Lösung: 135 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,6 mM CaCl _2, 1,2 mM MgCl _2, 3 mM Glucose und 20 mM HEPES; pH = 7,3).
   2. Wählen Sie die GFP-Kanal-Taste (525/50 nm-Emission). Identifizieren Sie die Zellmembran fluoreszierende Sonden auf Basis von grün fluoreszierenden von mEOS3 unter 488 nm Laseranregung ausdrückt. Stellen Sie sicher, dass fluoreszierende Kügelchen in der Nähe auch während der Bildgebung wie diese enthalten sind später für die Offline-dri erforderlich istft Korrektur.
   3. Klicken Sie auf die "Aufnahme" Taste, um ein TIRF Bild von der Zellmembran in mEOS3 (grün) Kanal als Referenzbild zu sammeln. Verwenden Sie eine flache abklingende Welle Anregungsbeleuchtung (nach den kritischen Winkel erreichen, biegen Sie weitere 2 Grad) von in 2120 in der TIRF Winkel eingeben Einstellung für Live-Cell-Imaging.
      ANMERKUNG: Dies minimiert die Fluoreszenz von dem ungebundenen mEos3-PH im Cytosol angrenzend an die Plasmamembran.
   4. Wechseln Sie in den "RFP-Kanal" Taste (561 nm Anregung, 600/50 nm-Emission). Verwenden Sie die volle Leistung 561 nm Laser-Hintergrundfluoreszenz der Membranblätter zu bleichen für 10 ~ 20 sec mit dem Scrollbar in der "AOTF pad" (siehe 3.1.4).
   5. Starten der Bildaufnahme die "Run Now" durch Klicken auf die Taste im roten Kanal (561 nm volle Leistung, eingestellt bei 10 ms / Frame in der "Kamera" Einstellung Tab) bei gleichzeitiger 405 nm Laseraktivierung. Stellen Sie die 405-nm-Laserintensität zu aktivieren räumlich getrennten Punktenin jedem Rahmen.
      HINWEIS: Erwerb Erlös, un-umgewandelt mEOS3.1-PH _{PLC δ1} Molekülzahl langsam abnimmt. Erhöhen Sie die 405 nm Laserleistung des einzelnen Moleküls Signal zu optimieren. Die Abbildungsakquisitionslänge ist abhängig von der experimentellen Zweck. Erwerben Sie Bilder kontinuierlich für 5 min unter normalen Bedingungen. Wenn eine längere Akquisition erforderlich ist, sammeln mehrere Bildstapel statt eines einzelnen, großen Bildstapel. Die Dateigröße der einzelnen Bildstapel sollte nicht mehr als 4 GB oder es wird später Software-Analyse beeinflussen.

4. SMLM Bildverarbeitung und Wiederaufbau

1. Übertragen Sie die Bilddateien (TIF-Bildstapel) zu einer Bildanalysestation. Starten Sie die Bildwiederaufbauprogramm (speziell geschriebenen) in Matlab wie zuvor ³⁷ beschrieben und laden Sie die Bildstapel durch die Registerkarte "Datei" im Hauptmenü klicken, dann auf "öffnen", dann "neue Datei".
2. Identifizieren und locaLize einzelnen molekularen Ereignisse aus jedem Rahmen. Stellen Filterung Intensitätsschwelle mit einer Schwellenzahl (1-10) in der "Wavelet". Überprüfen Sie die optimalen Parametereinstellungen für Punkterkennung visuell vor dem Umbau. Dann gehen Sie auf die "PALM" und klicken Sie "einen Schritt Prozess" Bildrekonstruktion zu starten.
   HINWEIS: Intensitäts-Grenzwert für Punkterkennung ist willkürlich und hängt von persönlichen Erfahrungen. Mehrere Studien kann eine optimale Detektionsschwelle zu erzeugen, erforderlich sein, dass weder zu viele unqualifizierte aufgreift (dim) Punkte noch filtert zu viele qualifizierte (hell) Punkte aus. Stellen Sie andere Parameter Datenanalyse zu optimieren. Hier Nachbarschaft Abstand (Fluoreszenzpunkte in den benachbarten Rahmen in einem Abstand kombiniert werden) wird als 65 nm (1/2 Pixelbreite) und als ein einzelnes Molekül eingebaut. Gap-Frames (Einzelmolekül Ereignisse, die innerhalb dieser Rahmen und Nachbarschaft Entfernung auftraten, wurden kombiniert und als ein einzelnes Molekül Ereignis vorhanden) istSet als 26 Frames (1,3 sec) für PAmCherry1 Bildgebung ^40. Stellen Sie diese Parameter entsprechend den Eigenschaften der Einzelmolekülsonden und Erfassungsrate zu vermeiden ⁴⁰ in SMLM Über zählen. Anwenden Driftkorrektur mit fluoreszierenden Kügelchen während der Rekonstruktionen.
   1. Für die Abbildung der festen Membranblätter gekennzeichnet durch iRFP-PAmCherry1-PH _{PLC δ1,} rekonstruieren die ganze Bildstapel aus der gleichen Membranfolie in einem einzigen Super-Resolution Bild ^37.
   2. Für lebende Zelle markierten Proben von mEOS3.1-PH _{PLC δ1,} den gesamten Bildstapel in mehrere kleinere Stapel von 1.000 Frames trennen , so dass 1000-konsekutiven Rahmen Stapel wird als ein einzelnes Superauflösungsbild rekonstruiert, die eine zeitliche Auflösung hat von 10 sec. Am Ende vereinen alle Zeitreihen - Bilder in der letzten Zeitreihenstapel ^23.
      HINWEIS: In lebenden Zellen PALM-Bildgebung kann eine kleine Anzahl der aktivierten Sonden bewegen oder trennenvon PI (4,5) P ₂ in der PM vor dem Bleichen. Um der Überabtastungs der Sonden verbinden einzelnen Molekül Signale in den benachbarten Einzelbildern innerhalb von 130 nm (anstelle von 65 nm) in einem einzigen Emissionsereignis während der Bildanalyse.
3. Nachdem die rekonstruierten Bilder zu erhalten, führen Sie weitere Bildanalyse mit dem speziell geschriebenen Programm in Matlab Moleküldichte, Mikrodomänendichte / Größe und Clusteranalyse mit paar Korrelation ⁴¹ zu quantifizieren.

Ergebnisse

Die Lokalisierungsunsicherheit (σ) unserer Super-Resolution - System ist 14,73 nm ^23. Direkte Vergleiche zwischen TIRF und PALM Bilder zeigten eine signifikante Verbesserung der räumlichen Auflösung. 3A-B zeigt die repräsentative PI (4,5) P ₂ TIRF Bilder markiert mit PI (4,5) P ₂ - Antikörper und iRFP-PAmCherry1-PH _{PLC δ1} in typischen Membranfolien und lebenden Zellen. Die Bilder mit herkömmlichen TIRF - Mikroskopie in Membranblätter bemerkenswert ähnlich sind zu denjenigen in intakten lebenden mit dem enhanced green fluorescence protein markierten Zellen (EGFP) tagged PH Domänen (EGFP-PH _PLCδ1) (3C). Alle Proben zeigten eine gleichmäßige Verteilung von Sonden. Im Gegensatz dazu führte nicht optimale Fixierung der Proben in scharfen dichten PI (4,5) P ₂ -Clustern und eine Abnahme der Signalintensität (Abbildung 4). Unter optimalen Fixierbedingungen, ter super-aufgelöste Bilder von PI (4,5) P ₂ in fixierten Zellen (Figur 5) zeigte eine homogene Verteilung von Sonden in einem erheblichen Teil des PM nur begrenzten Konzentrationsgradienten. Einige Membranflecken angereichert mit PI (4,5) _P2 - Sonden wurden dünn verteilt und hatten verschiedene Größen. Live Cell PALM Bilder zeigen eine ähnliche räumliche Verteilung als feste Zellen (Abbildung 6). Eine detaillierte Analyse von PI (4,5) _P2 Signale über die Zeit resultiert in schnelle Dynamik in lokalen Bereichen, ohne wesentliche Änderungen ihrer Fülle in weiten Bereichen.

Abbildung 1. Schema für Fluoreszenzsonden in dieser Studie verwendet. (AB) iRFP-PAmCherry1-PH _{PLC δ1} Sonde in den festen Membranfolie Experimente verwendet. Während herkömmliche TIRF imaging (A), eine 640 nm Laser wird verwendet, um die iRFP zu erregen (Ex: 692 nm; Em: 713 nm). TIRF Bild in diesem Zustand genommen dient als TIRF Referenzbild für die superauflösende Bildgebung von PALM - Bildgebung (B) erhalten. A 405-nm-Laser verwendet wird Photo aktivieren Sie die PAmCherry1 Fluorophor und ein 561-nm-Laser verwendet wird PAmCherry1 zu erregen (Ex: 564 nm; Em: 595 nm) für PALM-Bildgebung. (CD) mEos3.1-PH _PLCδ1 Sonde in den lebenden Zellen Experimente verwendet. (C) Bei der konventionellen TIRF Bildgebung, ein 488 nm - Laser verwendet mEOS3.1 (Ex: 506 nm; Em: 519 nm) anzuregen. (D) Nach dem Photokonversion von einem 405 - nm - Laser, wird mEos3.1 in die rote Form (Beispiel: 573 nm; Em: 584 nm). Und einem 561 - nm - Laser wird für PALM Akquisitionen Bitte hier klicken , um eine größere Version zu sehen diese Figur.

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Abbildung 2. Schema für Membranblatt Vorbereitung von INS-1 - Zellen. (A) Legen Sie das Deckglas mit kultivierten Zellen nach unten auf einen PDL-beschichtete Deckglas und warten auf 7 ~ 10 min bei 4 ° C Zellbindung an die PDL- zu ermöglichen beschichtete Deckglas. (B) die obere Deckglas mit einer Pinzette abziehen und fixieren Sie die Folienmembran auf die vorbeschichteten Deck PDL angebracht. (C) Bild der Proben mit TIRFM und PALM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. PI (4,5) P ₂ räumliche Organisation ist ähnlich zwischen den Membranblättern und intakten lebenden Zellen unter konventionellen TIRF - Mikroskop. (A) Atypische TIRF Bildbögen Membran bei 4 ° C mit 4% PFA und 0,2% GA fixiert. PI (4,5) P ₂ wurde mit PI (4,5) P ₂ spezifische Antikörper markiert. (B) ein Membranblatt von der INS-1 - Zellen iRFP-PAmCherry1-PH _{PLC δ1} exprimieren. (C) TIRF - Bild von zwei intakten lebenden Zellen EGFP-PH _PLCδ1 auf verschiedenen Ebenen. Maßstabsbalken: (A): 3 & mgr; m; (B) und (C):. 5 & mgr; m Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. PI (4,5) P ₂ räumliche Organisation in Membranblätter ist empfindlich gegen gemeinsamen Fixierbedingungen. (A) Membranblätter bei 37 ° C mit 4% PFA alleinund PI (4,5) P ₂ - spezifischen Antikörpers (wie in 3A) markiert. (B) Membranfolie bei RT mit PFA fixiert allein und mit PI (4,5) P ₂ spezifische Antikörper markiert. Man beachte , dass die dichten Cluster von PI (4,5) P ₂ Sonden unter TIRF Mikroskop deutlich sichtbar sind, im Gegensatz zu den viel gleichmäßiger Fluoreszenzbilder in 3A gezeigt. Maßstabsbalken: AB:. 3 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. PALM Bildgebung von PI (4,5) P ₂ Sonden zeigt ihre Nanometer - Skala Verteilung in einem INS-1 - Zellen Uhr. (A) iRFP TIRF Bild einer Membranfolie aus einer INS-1 - Zellen exprimiert iRFP-PAmCherry1-PH _PLCδ1. (B) entsprechende PALM Bild von PM in der gleichen Region basierend auf PAmCherry1 Signalrekonstruktion. Beachten Sie die homogene PI (4,5) P ₂ räumliche Verteilung in großen PM Regionen und mehrere PI (4,5) P ₂ Mikrodomänen. (C) eine vergrößerte Ansicht des eingerahmten Bereichs in (B). Pfeile zeigen dünn mit PI (4,5) P ₂ Sonden angereichert PM Mikrodomänen verteilt. Maßstabsbalken: A und B: 3 um; C: 500 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. PALM Bildgebung in der Live - INS-1 - Zellen. (A) TIRF Bild von PI (4,5) P ₂ in einer Live - INS-1 - Zellen mEos3.1-PH _PLC exprimieren_δ1. Das Bild wurde in den grünen Kanal vor PALM Erwerb (35 ° C) schnell erworben. (B) Sequential lebenden Zellen PALM Bilder in 10 Sekunden - Intervall. Einschübe zeigen die Intensitätsprofile des lokalen PI (4,5) P ₂ Dichte entlang der gleichen Position gerade Linie 1 zu verschiedenen Zeitpunkten in (B) und (C). Beachten Sie ihre großen lokalen Intensitätsänderungen innerhalb von 10 Sekunden. (D) Zeitverlauf der durchschnittlichen Intensitätsänderungen von PI (4,5) P ₂ in der großen Fläche (box2, 3x3 um) und kleine Kreise (3, 4, und 5, 500 nm Durchmesser) in (B) während 5 min von PALM-Bildgebung (Rahmen / 10 sec). Beachten Sie die schnelle Intensitätsschwankungen der lokalen PI (4,5) P ₂ Sonden (Kreis 3, 4 und 5) im Vergleich zu sehr kleine Veränderungen in der breiten Fläche (Kasten 2). (E) Vergrößerte PALM Bilder der box2 Region in (B) zu den angegebenen Zeiten. Die Pfeile zeigen PI (4,5) P ₂ angereicherte Membranflecken unter physiological Bedingungen. Maßstabsbalken: C: 3 um; E: 500 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Zur Fehlersuche, müssen zwei Prozesse besondere Aufmerksamkeit: Membranfolie Produktion und Probenfixierung. Wie in dem Protokoll beschrieben, ist die Inkubationszeit von den Deckgläsern in Schritt 1.1.6 wichtig für die Membranfolie Produktion. Optimale Inkubationszeit unter unseren experimentellen Bedingungen ist 7-10 min (Abbildung 2). Länger als 10 Minuten Inkubation werden intakte Zellen produzieren anstelle der Membranblätter auf PDL Deck und kürzere Inkubation wird weniger oder kein Membranblätter auf den PDL-beschichtete Deckgläser führen. Wie in dem Protokoll beschrieben, sind die Fixiermittel und Temperatur während der Fixierung der kritischen PI (4,5) P ₂ -Verteilung im PM aufrechtzuerhalten. Die Fixierung bei RT oder die Verwendung von 4% -PFA allein könnte die normale Lipidverteilung in der PM verzerren.

Durch die Anwendung PALM - Mikroskopie Lipidforschung an der Membran, sind wir in der Lage , die Nanometer - Skala Verteilung von PI (4,5) _P2, ein Schlüssel Phosphoinositid , die m vermittelt zu beobachtenalle grundlegenden zellulären Aktivitäten. Diese räumliche Verteilung von PI (4,5) _P2 mit begrenzter Konzentrationsgradienten in INS-1 - Zellen bietet einen Rahmen Lipid-Protein - Wechselwirkungen und lokale Signalereignisse von PI (4,5) P ₂ in diesen Zellen für ein Umdenken. Darüber hinaus sind die in dieser Arbeit entwickelten Methoden können auch mit der richtigen Sonden, wodurch bietet neue Werkzeuge zum Studium Phosphoinositiden in biologischen Prozessen zu anderen Membran Phospholipid Forschung angewendet werden.

Die Verwendung von Membranfolien in dieser Arbeit umgeht zwei wichtige Anliegen in Phospholipid morphologische Studien: Detergens-Behandlung und mögliche Signal Kontamination aus dem Cytosol. Waschmittel verursachen oft Clustering und einen erheblichen Verlust von PM Phospholipid-Signal. Die Kontamination von zytosolischen Signal ist besonders problematisch im Fall von geringer Häufigkeit Phosphoinositiden auf der PM ^23, wie beispielsweise PI (3,4,5) P ₃ und PI (3,4) P _2. Membranfolienproben sind in der Lage Circumvent diese Probleme ohne wesentliche Strukturen mit der Plasmamembran, wie kortikale Aktin meshwork und Clathrin-beschichtete Pits ^42,43 zugeordnet stören. Die relative homogene Verteilung von PI (4,5) _P2 in der PM ist in guter Übereinstimmung mit anderen schnellen Einfrieren EM - Studien unter Verwendung von GST-PH _{PLC δ1} Sonden in der Fibroblasten - Membran ^44.

Es ist wichtig zu beachten, dass unsachgemäßer Probenverarbeitungsbedingungen irreführende Ergebnisse erzeugen kann. Erstens ist es wichtig, die Befestigungsschritte bei einer niedrigeren Temperatur (4 ° C) und Verwendung der Fixiermittel GA für Membranfolienherstellung durchzuführen. Wie in 3 gezeigt, warme Temperatur und PFA Fixierung ohne GA ist nicht ausreichend Phosphoinositid in Zelle PM zu beheben. Dies könnte die intakten PI (4,5) P ₂ Verteilung verzerren und scharfe Cluster erzeugen , die in lebenden Zellen unter physiologischen Bedingungen beobachtet werden , nicht. Zweitens ist die Verwendung von PAmCherry1 alsdie SMLM Sonde, eher als andere Sonden ist, ausschlaggebend für die quantitative PALM-Bildgebung. Der Vorteil der PAmCherry1 Anwendung kommt von seiner gut charakterisierten einzelnen molekularen photophysikalischen Eigenschaften ^35,40,45, wie Helligkeit, hohe Photoaktivierung Effizienz und vor allem sehr begrenzt Photo Blinken. Diese Eigenschaften ermöglichen es uns , potenzielle Cluster Artefakte aus Photo Blinken zu beseitigen und quantitativ die molekulare Dichte der Membran PI analysieren (4,5) P _2.

Dieser Ansatz hat auch seine Grenzen. Erstens verwendet das Membranblatt Verfahren in dieser Studie nicht vollständig kann die physiologische Verteilung von PI (4,5) P ₂ nachahmen , da die Zelle vor der Abbildung gestört wird. Aber unsere Live - PALM - Bildgebung zeigt ähnliche relativ homogene Verteilung von PI (4,5) _P2, die Ergebnisse beobachtet , die mit Membranfolie Proben unterstützen. Zweitens, wie wir in unserer bisherigen Arbeit ²³ diskutiert, erfordert SMLM Imaging Expertise und extra antention Bildartefakte zu vermeiden, die von verschiedenen Prozessen, einschließlich der verwendeten Sonden, Probenvorbereitung und Fixierung, Bild Probenahme und Wiederaufbau entstehen könnten. Schließlich, obwohl die PH - Domäne basierte Sonden und Antikörper sind weit verbreitet in der Phosphoinositid Studien ^46,47 verwendet worden bleibt es möglich , dass nicht alle PI (4,5) _P2 in der Membran kann durch diesen Ansatz nachgewiesen werden. Beispielsweise PI (4,5) P ₂ durch andere endogene Proteine gebunden sind, können nicht auf pH - Sonden oder Antikörper zugänglich sein, und dies kann eine Unterschätzung von PI (4,5) P ₂ aufgrund der Raum Hinderung der Sonden selbst verursachen. Eine alternative Möglichkeit zur Etikettierung PI (4,5) P ₂ würde auf den Schwanz des ursprünglichen Top-Fluor PI (4,5) P ₂ ^48, a pre-markierten PI (4,5) P ₂ Analogon mit einer Modifikation verwendet werden , PI (4,5) P _2. Allerdings kann es schnell in andere Phosphoinositid-Subtypen durch schnelle Live-Zellstoffwechsel umgewandelt werden, da seine Inositolrings die gleiche wie endogenou ists PI (4,5) P _2. Damit stellt sich die Sorge , ob diese voretikettierten PI (4,5) P ₂ analoge in lebenden Zellen treu PI (4,5) P ₂ nicht seine Stoffwechselprodukte darstellen kann. Daher ist trotz einiger Einschränkungen, PH - Domäne basierte Sonden sind immer noch zu den besten Sonden , die häufig verwendet wurden PI (4,5) P ₂ Verteilung und Dynamik auf dem PM von Zellen zu überwachen.

Die künftige Anwendung dieser Methodik kann auf andere Phosphoinositid Studien erweitert werden, wie beispielsweise PI (3,4,5) P ₃ und PI (3,4) P _2. Zusammenfassend verwendet die neuartige SMLM Ansatz eröffnet hier neue Wege Phosphoinositid in Zellen zu untersuchen. Verwendung von PI (4,5) P ₂ als Beispiel zeigen wir die einzigartigen Eigenschaften von PALM Bildgebung in die morphologische und quantitative Untersuchung der Zellmembran - Moleküle sowie ihre Nachteile. Dieser Ansatz kann an andere Moleküle von Interessen angepasst werden und breite Anwendungen in der Zellbiologie haben.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Nikon	Ti-U
sCMOS camera	Andor	Neo
Spinning disk	Yokogawa	CSU X-1, 10,000 rpm
High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers.	Agilent	MLC400	laser original powers & powers at the end of optical fiber) 405 nm: 15 mW & 13 mW; 488 nm: 45 mW & 42 mW; 561 nm: 45 mW & 40 mW; 640 nm: 35 mW & 16 mW.
100X Objective	Nikon		APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12 mm
Nikon acquisition and analysis software (NIS Element)	Nikon
Matlab	MathWorks
Coverslip	Warner	64-0714	Round 18 mm coverslip, #1.5
Fibronectin	Millipore	FC010-5MG
Lipofectamin 3000 (transfection reagent)	Invitrogen	L3000-008
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	#16120
PI(4,5)P2 1st antibody	Santa Cruz	sc-53412
secondary antibody  F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21237
Tetraspeck beads	Invitrogen	T7279
magnetic quick release imaging chamber	Warner Instruments	Cat#641994
temperature controller	Warner Instruments	TC-344C
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Phosphate buffer saline	Sigma	P4417-100TAB
EGTA	Sigma	3780
NH4Cl	Sigma	A0171
Goat serum	Sigma	G9023
bovine serum albumin	Sigma	A7906
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
CaCl2•2H2O	Sigma	223506
MgCl2•6H2O	Sigma	M9272
Glucose	Sigma	G7021
HEPES	Sigma	H4034
Paraformaldyhyde	Sigma	P6148