Verbesserung der Bacillus subtilis-Sporenzählung und Markierungsanalyse in der Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von Durchflusszytometrie und Zählperlen zur Quantifizierung von Bakteriensporen, die mit Ethidiumbromid markiert sind. Die Methode ist auch effizient, um die kovalente Kopplung von Proteinen auf der Oberfläche intakter Sporen zu analysieren.

Zusammenfassung

Die Sporen von Bacillus subtilis wurden bereits für verschiedene biotechnologische und immunologische Anwendungen vorgeschlagen; Es besteht jedoch ein zunehmender Bedarf an der Entwicklung von Methoden, die den Nachweis von Antigenen, die auf der Oberfläche von Sporen immobilisiert sind, sowie deren Quantifizierung verbessern. Auf Durchflusszytometrie basierende Analysen wurden bereits als schnelle, zuverlässige und spezifische Ansätze zum Nachweis markierter Zellen von B. subtilis vorgeschlagen. In dieser Arbeit schlagen wir die Verwendung der Durchflusszytometrie vor, um die Anzeigeeffizienz eines fluoreszierenden Antikörpers (FA) auf der Oberfläche der Spore zu bewerten und die Anzahl der Sporen mit Hilfe von Zählkügelchen zu quantifizieren.

Dazu verwendeten wir Ethidiumbromid als DNA-Marker und einen Allophycocyanin (APC)-markierten Antikörper, der an die Sporen gekoppelt war, als Oberflächenmarker. Die Quantifizierung der Sporen wurde mit Hilfe von Zählkügelchen durchgeführt, da diese Technik eine hohe Genauigkeit bei der Detektion von Zellen aufweist. Die markierten Sporen wurden mit einem Durchflusszytometer analysiert, was die Kopplung bestätigte. Als Ergebnis konnte gezeigt werden, dass die DNA-Markierung die Genauigkeit der Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie für den Nachweis von gekeimten Sporen verbessert. Es wurde beobachtet, dass Ethidiumbromid nicht in der Lage war, ruhende Sporen zu markieren; Diese Technik ermöglicht jedoch eine genauere Bestimmung der Anzahl der Sporen mit fluoreszierendem Protein, die an ihre Oberfläche gekoppelt sind, und hilft so bei der Entwicklung von Studien, die sich auf die Verwendung von Sporen als biotechnologische Plattform in verschiedenen Anwendungen konzentrieren.

Einleitung

Bacillus subtilis ist ein stäbchenförmiges, grampositives Bakterium, das in der Lage ist, ruhende Sporen zu produzieren, wenn die Umweltbedingungen kein Zellwachstum zulassen¹. Sporen sind extrem stabile Zellformen, und die Sporen mehrerer Arten, einschließlich B. subtilis, werden häufig als Probiotika für den menschlichen und tierischen Gebrauch verwendet². Aufgrund ihrer Resistenz- und Sicherheitseigenschaften wurde die Spore von B. subtilis, die heterologe Proteine aufweist, als Schleimhautadjuvans, als Impfstoffverabreichungssystem und als Enzymimmobilisierungsplattform vorgeschlagen ^3,4.

Um Sporen von B. subtilis zu erhalten, ist es notwendig, sie mit einem speziellen Nährmedium einem Nährstoffentzug auszusetzen. Nach der Gewinnung und Reinigung dieser Sporen müssen sie quantifiziert werden, um die Testeffizienz zu verbessern ^5,6. Daher werden bestimmte Methoden angewendet, um die Konzentration der erhaltenen Sporen zu analysieren. Es kann eine Plattenzählung und eine Petroff-Hausser-Kammer, auch Zählkammer genannt, verwendet werden. Letzteres wurde ursprünglich entwickelt, um die Konzentration von Blutzellen zu bestimmen; Es ist jedoch möglich, es im Bereich der Mikrobiologie für die Sporenzählung zu verwenden ^7,8. Obwohl es sich um die Standardmethode für die Zellzählung handelt, ist das Ablesen mühsam, da diese Methode vollständig manuell ist und ihre Genauigkeit von der Erfahrung des Bedieners abhängt.

Durchflusszytometrie-basierte (FC) Analysen wurden bereits als schnelle, zuverlässige und spezifische Ansätze zum Nachweis markierter Zellen von Bacillus spp. vorgeschlagen. Die Verwendung von Durchflusszytometrie-Zählkügelchen hat die Reproduzierbarkeit bei der Zellzählung bei Routineuntersuchungen (absolute Zählung von CD4- und CD8-T-Lymphozyten) und bei der Entwicklung von Forschungsarbeiten mit Partikeln gewährleistet, die mit der Durchflusszytometrie nachgewiesen und gezählt werden können⁹. Godjafrey und Alsharif schlugen die Verwendung von Zählkügelchen zur FC-Quantifizierung von unmarkierten Sporen vor¹⁰. Der Einsatz der Durchflusszytometrie zur Überwachung der Sporulation bei Bacillus spp. durch Markierung der Sporen-DNA 10,11,12,13. In einer weiteren Studie wurde FC verwendet, um die Menge an fluoreszenzmarkierten Proteinen auf der Sporenoberfläche zu bewerten¹⁵.

Ziel dieser Studie war es, kommerzielle Zählkügelchen zu verwenden, um einen Standard der Reproduzierbarkeit in Bezug auf die Ereigniszählung mittels Durchflusszytometrie zu gewährleisten. In dieser Arbeit schlagen wir die Verwendung von Zählkügelchen für die Zellzählung in FC vor, um die Sporenzählung zu verfeinern und die Kopplungseffizienz von fluoreszenzmarkierten Antikörpern auf der Sporenoberfläche zu bewerten.

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Protokoll

In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Instrumenten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Einstellung der Durchflusszytometrie

1. Abgleich der optischen Parameter des an einen Computer gekoppelten Durchflusszytometers
   1. Melden Sie sich bei der Cytometer-Software an.
   2. Wählen Sie im Arbeitsbereich der Software die Option Zytometer | Starten und einige Minuten warten | Sauberer Modus | Flüssigkeiten im Sitzen zu sich nehmen.
      HINWEIS: Luftblasen und Verstopfungen wurden während des Zytometer-Initiierungsprozesses vor der Probenaufnahme entfernt.
2. Qualitätskontrolle
   1. Verwenden Sie das Reagenz zur Qualitätskontrolle, um die Spannungen der Photomultiplier-Röhren einzustellen und ihre Empfindlichkeit zu bewerten.
      1. Bereiten Sie das Reagenz für die Qualitätskontrolle in einem Styroporröhrchen vor.
      2. Um den Ausgangswert zu definieren, bereiten Sie die Suspensionskügelchen vor, indem Sie 0,5 ml Verdünnungsmittel (10 mM gefiltertes PBS, pH 7) und 3 Tropfen Kügelchen in das markierte Röhrchen geben.
      3. Mischen Sie die Durchstechflasche durch vorsichtige Umkehrung.
   2. Wählen Sie im Arbeitsbereich der Software die Option Zytometer | CST , um eine Verbindung zur CST-Schnittstelle herzustellen. Warten Sie einige Minuten und beobachten Sie, wie das Zytometer getrennt ist.
   3. Befestigen Sie das Polystyrolröhrchen mit dem Reagenz für die Qualitätskontrolle an der Durchflusszytometersonde.
3. Überprüfung der Konfiguration des Zytometers
   1. Überprüfen Sie im Fenster Systemübersicht , ob die Zytometerkonfiguration für das Experiment geeignet ist.
   2. Wählen Sie die entsprechende Chargen-ID für Setup-Perlen aus, um zu überprüfen, ob die ausgewählte Chargen-ID der Setup-Perlen mit der aktuellen Charge der CS&T-Forschungsperlen übereinstimmt.
4. Leistungsprüfung
   1. Wählen Sie die Option Leistung überprüfen und klicken Sie auf Ausführen.
   2. Nach Abschluss der Leistungsprüfung werden die Leistungsergebnisse angezeigt. Sehen Sie sich den Zytometer-Leistungsbericht an. Klicken Sie entweder auf Fertig stellen , um die Leistungsprüfung abzuschließen, oder entfernen Sie das Röhrchen aus dem Zytometer und überprüfen Sie die Ergebnisse im Fenster Systemübersicht .
   3. Beobachten Sie das Endergebnis der morphometrischen und Fluoreszenzsensitivitätsanalyse, das in der | Systemzusammenfassung| Zytometerleistungsergebnis | mit dem Status BESTANDEN angezeigt wird

2. Vorbereitung der Sporen

1. Nach der Sporulation die Sporen 3x mit hochreinem eiskaltem Wasser durch Zentrifugation bei 17.949 × g für 10 min abspülen.
2. Resuspendieren Sie das bei der letzten Zentrifugation erhaltene Pellet mit 10 ml Reinstwasser.
3. Autoklavieren Sie die Sporen 45 Minuten lang bei 121 ºC, um die vegetativen Zellen zu inaktivieren.
   ANMERKUNG: Frühere Tests, die von unserer Gruppe durchgeführt wurden, bei denen verschiedene Inaktivierungsmethoden verglichen wurden, zeigten, dass die in Schritt 2.3 genannten Bedingungen eine hohe Effizienz aufwiesen und keine Koloniebildung in der Plattierungsanalysemethode auf dem LB-Agar-Medium zeigten.

3. Quantifizierung autoklavierter Sporen mittels Durchflusszytometrie

1. Nehmen Sie 50 μl autoklavierte Sporen und inkubieren Sie sie lichtgeschützt mit Ethidiumbromid (EtBr, 10 mg/ml in Wasser verdünnt) bei einem Verdünnungsfaktor von 0,05 % v/v für 30 Minuten (Abbildung 1A).
2. Waschen Sie die Sporen 3x mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Zentrifugation bei 17.949 × g für 10 min und resuspendieren Sie in 1x PBS.
3. Fügen Sie 10 μl Kügelchen hinzu und befolgen Sie dabei die Verdünnungsempfehlungen des Herstellers.
4. Analysieren Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer, wie in Schritt 4 beschrieben.
   HINWEIS: Es ist wichtig zu betonen, dass die Kügelchen so homogen wie möglich pipettiert werden sollten, da bei den Berechnungen Unterschiede beobachtet wurden, wenn dieser Schritt nicht gut ausgeführt wurde.

4. Analyse mittels Durchflusszytometrie

1. Melden Sie sich bei der Cytometer-Software an.
2. Wählen Sie im Arbeitsbereich der Software die Option Zytometer | Sauberer Modus | Flüssigkeiten im Sitzen zu sich nehmen.
3. Passen Sie den Arbeitsbereich an, um die Analyse in der Durchflusszytometrie zu bestimmen.
   1. Definieren Sie die Gates für die Analysen (Abbildung 2).
      1. Definieren Sie die Gating-Strategie basierend auf den morphometrischen und Fluoreszenzeigenschaften der Partikel auf der Grundlage der Negativkontrolle (unmarkierte Sporen).
   2. Um die Zellmorphometrie zu bestimmen, wählen Sie Dotplot-Grafik für Analysen der FSC-A-Parameter auf der x-Achse und SSC-A auf der y-Achse.
   3. Um die Fluoreszenz zu bestimmen, wählen Sie FL3 Dotplot-Diagramme auf der y-Achse mit FL5 auf der x-Achse und erstellen Sie die Gates in vier Quadranten.
4. Verwenden Sie ein 12 x 75 mm Polystyrolröhrchen mit Stopfen und unmarkierten Proben, die zuvor mit einfarbigem EtBr, einfarbigem APC und mehrfarbigem EtBr+ APC gekennzeichnet waren.
5. Mischen Sie das Röhrchen mit der Negativkontrolle sehr vorsichtig und befestigen Sie es an der Durchflusszytometersonde.
6. Klicken Sie auf Erwerben.
7. Stellen Sie die Leistung der Laser ein, indem Sie zu Zytometer | Parameter | FSC (375) und SSC (275).
8. Stellen Sie den Schwellenwert auf (500) ein Zytometer | Schwellenwert.
9. Um die Autofluoreszenz zu entfernen, analysieren Sie die farbstofffreie Probe, die nur Sporen enthält.
10. Passen Sie die Spannungen für die Filterdetektoren FL3 (603) und FL5 (538) an, um negative und positive Populationen in Bezug auf die gewählte Fluoreszenz in den Kontrollen zu unterscheiden. Zytometer | Parameter.
11. Zytometer | Schadenersatz | Stellen Sie den FL5/FL3-Setup-Offset auf 1,0 ein.
12. Konfigurieren Sie das Gerät nach der Morphometrie und Fluoreszenzanalyse für die Erfassung von 30.000 Ereignissen | Experimentieren | Versuchsanordnung | Akquisition |30.000 Veranstaltungen....
13. Nachdem Sie die Parameter angepasst haben, erfassen Sie Daten für die Proben, die markiert sind und Kügelchen im Durchflusszytometer enthalten.
14. Berechnen Sie die Sporenkonzentration gemäß den Anweisungen des Herstellers anhand von Gleichung (1).
    (1)
    ANMERKUNG: Für diese Studie wurde die Methode zur Quantifizierung der Kügelchen mit der Petroff-Hausser-Zählkammeranalyse verglichen. Darüber hinaus wurde die Markierung von autoklavierten Sporen mit der Markierung von nicht autoklavierten Sporen verglichen.

5. Abschätzung des Proteinkopplungsindex auf einer Sporenoberfläche mittels Durchflusszytometrie

1. Ernte durch Zentrifugieren von 50 μl Sporen (10³/μl) 17.949 × g für 10 min und dann Resuspendierung mit 25 μl 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) (300 mM)).
2. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
3. 25 μl N-Hydroxysulfosuccinimid (NHS) (50 mM) zur Sporensuspension geben und bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
4. Waschen Sie die Sporen 3x mit 1x PBS durch Zentrifugieren, wie in Schritt 5.1 beschrieben.
5. Fügen Sie fluoreszierendes Protein hinzu und lassen Sie die Proben über Nacht bei 15 °C stehen.
   HINWEIS: Das fluoreszierende Protein, das in dieser Arbeit verwendet wurde, war ein APC-markierter Anti-Human-IL-10-Antikörper. Dieser Antikörper wurde als Modell für die Studie verwendet, obwohl die Anwendung anderer fluoreszierender Moleküle möglich ist, da EDC/NHS eine kovalente Ligation zwischen -COOH- und -_NH2-Gruppen fördern, die in Proteinen auf der Sporenoberfläche vorhanden sind.
6. Waschen Sie die Sporen gemäß Schritt 5.3.
7. 10 mg/ml Ethidiumbromid in einer Verdünnung von 1:50 zugeben und 1 Stunde auf Eis und vor Licht geschützt stehen lassen (Abbildung 1B).
8. Waschen Sie die Sporen gemäß Schritt 5.3.
9. Wiederholen Sie Schritt 4.
10. Um die Fluoreszenz zu bestimmen, ändern Sie die Parameter FL3 auf der X-Achse und FL5 auf der Y-Achse des Punktdiagramms.
11. Analysieren Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer mit dem blauen Laser (488 nm) bei FL3 (670 LP-Filter) und dem roten Laser (633 nm) bei FL5 (660/20-Filter), wie in Schritt 4 beschrieben.
    HINWEIS: Dieselben Proben wurden auf Objektträgern unter einem Mikroskop bei einem Vergrößerungsbereich von 1.000-fach und mit den folgenden Filtern auf Immunfluoreszenz analysiert: FITC 480/30 nm (grün) und TRITC 540/25 nm (rot).

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Ergebnisse

In autoklavierten Sporenproben (AS) wurden 2 × 10³ Sporen/μl und 1 × 10³ Sporen/μl mit Hilfe von Zählkügelchen bzw. der Petroff-Hausser-Methode nachgewiesen (Abbildung 2).

Abbildung 1: Allgemeines Schema zur Quantifizierung von Sporen. (A) Sporen, die mit EtBr mark...

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Diskussion

Herkömmliche Methoden, wie z.B. die Plattenzählung von Kolonien, sind nicht nur zeitaufwändig, sondern benötigen auch lebensfähige Zellen und erlauben keine Quantifizierung von inaktivierten Sporen⁵. Die Petroff-Hausser-Kammer ist eine alternative Methode, aber sie erfordert einen erfahrenen Mikroskopiker, um sie durchzuführen. Die Durchflusszytometrie hat sich hierfür als sinnvolle Alternative erwiesen.

Genovese et ^al.12 beschrieben die V...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(N-hydroxysuccinimide) (NHS)	Sigma	130672
Anti-human fluorescent antibody	BioLegend	501410	APC anti-human IL-10
Anti-mouse fluorescent antibody	Thermo Scientific	A32723	Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II	BD		Flow cytometer
BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x)	BD	642412	Quality control reagent
BD FACSDiva Software v. 6.1.3	BD	643629	Software
Centrifuge MegaFuge 8R	Thermo Scientific	75007213
Counting Beads	BD	340334	TruCount Tubes
Eclipse 80i	Nikon		Fluorescent Microsope
Ethidium Bromide	Ludwig Biotec
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	A4503
Plastic Microtubes	Eppendorf
Polystyrene tube	Falcon	352008	5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile