Amélioration du dénombrement des spores de Bacillus subtilis et de l’analyse des marquages en cytométrie en flux

Résumé

Ce protocole se concentre sur l’utilisation de la cytométrie en flux et des billes de comptage pour quantifier les spores bactériennes marquées au bromure d’éthidium. La méthode est également efficace pour analyser le couplage covalent des protéines à la surface des spores intactes.

Résumé

Les spores de Bacillus subtilis ont déjà été proposées pour différentes applications biotechnologiques et immunologiques ; Cependant, il est de plus en plus nécessaire de développer des méthodologies qui améliorent la détection des antigènes immobilisés à la surface des spores ainsi que leur quantification. Les analyses basées sur la cytométrie en flux ont déjà été proposées comme des approches rapides, fiables et spécifiques pour détecter les cellules marquées de B. subtilis. Ici, nous proposons l’utilisation de la cytométrie en flux pour évaluer l’efficacité d’affichage d’un anticorps fluorescent (FA) à la surface de la spore et quantifier le nombre de spores à l’aide de billes de comptage.

Pour cela, nous avons utilisé le bromure d’éthidium comme marqueur d’ADN et un anticorps marqué à l’allophycocyanine (APC), qui a été couplé aux spores, comme marqueur de surface. La quantification des spores a été réalisée à l’aide de billes de comptage car cette technique démontre une grande précision dans la détection des cellules. Les spores marquées ont été analysées à l’aide d’un cytomètre en flux, ce qui a confirmé le couplage. En conséquence, il a été démontré que le marquage de l’ADN améliorait la précision de la quantification par cytométrie en flux, pour la détection des spores germées. On a observé que le bromure d’éthidium n’était pas en mesure de marquer les spores dormantes ; Cependant, cette technique permet de déterminer plus précisément le nombre de spores avec des protéines fluorescentes couplées à leur surface, contribuant ainsi au développement d’études axées sur l’utilisation des spores comme plate-forme biotechnologique dans différentes applications.

Introduction

Bacillus subtilis est une bactérie gram-positive en forme de bâtonnet qui est capable de produire des spores au repos lorsque les conditions environnementales ne permettent pas la croissance cellulaire¹. Les spores sont des formes cellulaires extrêmement stables et celles de plusieurs espèces, dont B. subtilis, sont largement utilisées comme probiotiques à usage humain et animal². En raison de ses propriétés de résistance et d’innocuité, la spore de B. subtilis, qui présente des protéines hétérologues, a été proposée comme adjuvant muqueux, système d’administration de vaccins et plate-forme d’immobilisation enzymatique ^3,4.

Pour obtenir des spores de B. subtilis, il est nécessaire de l’exposer à une privation de nutriments à l’aide d’un milieu de culture spécial. Après avoir obtenu et purifié ces spores, il faut les quantifier pour améliorer l’efficacité du test ^5,6. Ainsi, certaines méthodes sont appliquées pour analyser la concentration des spores obtenues. Il est possible d’utiliser le comptage des plaques et une chambre Petroff-Hausser, également connue sous le nom de chambre de comptage. Ce dernier a été développé à l’origine pour déterminer la concentration des cellules sanguines ; Cependant, il est possible de l’utiliser dans le domaine de la microbiologie pour le comptage des spores ^7,8. Bien qu’il s’agisse de la méthode standard utilisée pour le comptage cellulaire, la lecture est laborieuse car cette méthode est entièrement manuelle et sa précision dépend de l’expérience de l’opérateur.

Les analyses basées sur la cytométrie en flux (FC) ont déjà été proposées comme des approches rapides, fiables et spécifiques pour détecter les cellules marquées de Bacillus spp. L’utilisation de billes de comptage de cytométrie en flux a permis de garantir la reproductibilité dans le comptage cellulaire, dans les examens de routine (numération absolue des lymphocytes T CD4 et CD8) et dans le développement de la recherche portant sur des particules susceptibles d’être détectées et comptées par cytométrie en flux⁹. Godjafrey et Alsharif ont suggéré l’utilisation de billes de comptage pour la quantification de la FC des spores non marquées¹⁰. L’utilisation de la cytométrie en flux a été décrite pour le suivi de la sporulation chez Bacillus spp. par marquage de l’ADN des spores 10,11,12,13. Une autre étude a utilisé FC pour évaluer la quantité de protéines marquées par fluorescence à la surface des spores¹⁵.

Cette étude visait à utiliser des billes de comptage commerciales pour assurer une norme de reproductibilité en ce qui concerne le comptage d’événements à l’aide de la cytométrie en flux. Dans cet article, nous suggérons l’utilisation de billes de comptage pour le comptage cellulaire dans la FC afin d’affiner le dénombrement des spores et d’évaluer l’efficacité du couplage des anticorps marqués par fluorescence à la surface des spores.

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Protocole

Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et logiciels utilisés dans ce protocole.

1. Réglage de la cytométrie en flux

1. Alignement des paramètres optiques d’un cytomètre en flux couplé à un ordinateur
   1. Connectez-vous au logiciel Cytometer.
   2. Dans l’espace de travail du logiciel, sélectionnez Cytomètre | Démarrez et attendez quelques minutes | Mode de nettoyage | S’asseoir liquides.
      REMARQUE : Les bulles d’air et les obstructions ont été éliminées pendant le processus d’initiation du cytomètre, avant l’acquisition de l’échantillon.
2. Contrôle qualité
   1. Utilisez le réactif de contrôle qualité pour ajuster les tensions des tubes photomultiplicateurs et évaluer leur sensibilité.
      1. Préparez le réactif de contrôle qualité dans un tube en polystyrène.
      2. Pour définir la ligne de base, préparez les billes de suspension en ajoutant 0,5 mL de diluant (10 mM de PBS filtré, pH 7) et 3 gouttes de billes dans le tube étiqueté.
      3. Mélangez le flacon de billes par inversion douce.
   2. Dans l’espace de travail du logiciel, sélectionnez Cytomètre | CST pour se connecter à l’interface CST. Attendez quelques minutes et observez le cytomètre à message déconnecté.
   3. Fixez le tube en polystyrène contenant le réactif de contrôle qualité à la sonde du cytomètre en flux.
3. Vérification de la configuration du cytomètre
   1. Dans la fenêtre Récapitulatif du système , vérifiez que la configuration du cytomètre est adaptée à l’expérience.
   2. Sélectionnez l’ID de lot de perles de configuration correspondant pour vérifier que l’ID de lot de perles de configuration sélectionné correspond au lot actuel de billes de recherche CS&T.
4. Vérification des performances
   1. Sélectionnez l’option Vérifier les performances et cliquez sur Exécuter.
   2. Une fois la vérification des performances terminée, les résultats des performances seront affichés. Consultez le rapport sur les performances du cytomètre. Cliquez sur Terminer pour terminer la vérification des performances ou retirez le tube du cytomètre et examinez les résultats dans la fenêtre Résumé du système .
   3. Observez le résultat final de l’analyse morphométrique et de sensibilité à la fluorescence qui apparaîtra dans le | résumé du système| résultat de la performance du cytomètre| avec l’état : RÉUSSI

2. Préparation des spores

1. Après sporulation, rincez les spores 3 fois avec de l’eau glacée ultra-pure par centrifugation à 17 949 × g pendant 10 min.
2. Remettre en suspension la pastille obtenue lors de la dernière centrifugation avec 10 mL d’eau ultrapure.
3. Autoclaver les spores pendant 45 min à 121 ºC pour l’inactivation des cellules végétatives.
   NOTE : Des tests antérieurs effectués par notre groupe comparant différentes méthodes d’inactivation ont démontré que les conditions mentionnées à l’étape 2.3 présentaient une efficacité élevée, ne montrant aucune formation de colonies dans la méthode d’analyse de placage sur le milieu gélosé LB.

3. Quantification des spores autoclavées par cytométrie en flux

1. Prélever 50 μL de spores autoclavées et les incuber à l’abri de la lumière avec du bromure d’éthidium (EtBr, 10 mg/mL dilué dans de l’eau) à un facteur de dilution de 0,05 % v/v pendant 30 min (Figure 1A).
2. Laver les spores 3 fois avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par centrifugation à 17 949 × g pendant 10 min et les remettre en suspension dans 1 x PBS.
3. Ajouter 10 μL de billes en suivant les recommandations du fabricant pour la dilution.
4. Analysez l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux comme décrit à l’étape 4.
   REMARQUE : Il est important de souligner que les billes doivent être pipetées de la manière la plus homogène possible car des disparités ont été observées dans les calculs lorsque cette étape n’a pas été bien exécutée.

4. Analyse par cytométrie en flux

1. Connectez-vous au logiciel Cytometer.
2. Dans l’espace de travail du logiciel, sélectionnez Cytomètre | Mode de nettoyage | S’asseoir liquides.
3. Ajustez à l’espace de travail pour déterminer l’analyse en cytométrie en flux.
   1. Définissez les portes pour les analyses (Figure 2).
      1. Définir la stratégie de déclenchement en fonction des caractéristiques morphométriques et de fluorescence des particules en fonction du témoin négatif (spores non marquées).
   2. Pour déterminer la morphométrie cellulaire, choisissez Dotplot graphic (Graphique en points ) pour l’analyse des paramètres FSC-A sur l’axe des x et SSC-A sur l’axe des y.
   3. Pour déterminer la fluorescence, choisissez FL3 Dotplot plots sur l’axe des ordonnées à l’aide de FL5 sur l’axe des abscisses et créez les portes dans quatre quadrants.
4. Utilisez un tube en polystyrène bouché de 12 x 75 mm contenant des échantillons non étiquetés, préalablement étiquetés avec de l’EtBr unicolore, de l’APC unicolore et de l’EtBr+ APC multicolore.
5. Mélangez très délicatement le tube contenant le témoin négatif et fixez-le à la sonde du cytomètre en flux.
6. Cliquez sur Acquérir.
7. Réglez la puissance des lasers en accédant à Cytomètre | Paramètres | FSC (375) et SSC (275).
8. Réglez le seuil sur (500) Cytomètre | Seuil.
9. Pour éliminer l’autofluorescence, analysez l’échantillon sans colorant contenant uniquement des spores.
10. Ajustez les tensions des détecteurs de filtres : FL3 (603) et FL5 (538) pour discriminer les populations négatives et positives par rapport à la fluorescence choisie dans les témoins. Cytomètre | Paramètres.
11. Cytomètre | Rémunération | Définissez le décalage de configuration FL5/FL3 sur 1,0.
12. Après l’analyse morphométrique et fluorescente, configurez l’appareil pour l’acquisition de 30 000 événements | Expérimentez | Mise en page de l’expérience | Acquisition |30 000 événements....
13. Après avoir ajusté les paramètres, acquérez des données pour les échantillons qui sont étiquetés et contiennent des billes dans le cytomètre en flux.
14. Calculer la concentration de spores telle que décrite dans les instructions du fabricant à l’aide de l’équation (1).
    (1)
    NOTE : Pour cette étude, la méthode de quantification des billes a été comparée à l’analyse de la chambre de comptage de Petroff-Hausser. De plus, le marquage des spores autoclavées a été comparé à celui des spores non autoclavées.

5. Estimation de l’indice de couplage protéique à la surface d’une spore par cytométrie en flux

1. Prélever par centrifugation 50 μL de spores (10³/μL) 17 949 × g pendant 10 min, puis remettre en suspension 25 μL de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) (300 mM)).
2. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
3. Ajouter 25 μL de N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) (50 mM) à la suspension de spores et l’incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
4. Lavez les spores 3x avec 1x PBS par centrifugation comme décrit à l’étape 5.1.
5. Ajouter les protéines fluorescentes et laisser les échantillons toute la nuit à 15 °C.
   NOTE : La protéine fluorescente utilisée dans ce travail était un anticorps anti-IL-10 humain marqué par APC. Cet anticorps a été utilisé comme modèle pour l’étude, bien que l’application d’autres molécules fluorescentes soit possible puisque l’EDC/NHS favorise une ligature covalente entre les groupes -COOH et -NH₂ présents dans les protéines à la surface des spores.
6. Lavez les spores conformément à l’étape 5.3.
7. Ajouter 10 mg/mL de bromure d’éthidium dilué à 1 :50, puis laisser reposer 1 h sur glace et à l’abri de la lumière (figure 1B).
8. Lavez les spores conformément à l’étape 5.3.
9. Répétez l’étape 4.
10. Pour déterminer la fluorescence, modifiez les paramètres FL3 sur l’axe X et FL5 sur l’axe Y du diagramme à points.
11. Analysez l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux avec le laser bleu (488 nm) à FL3 (filtre 670 LP) et le laser rouge (633 nm) en FL5 (filtre 660/20), comme décrit à l’étape 4.
    REMARQUE : Les mêmes échantillons ont été analysés pour l’immunofluorescence sur des lames au microscope, à une plage de grossissement de 1 000 x et à l’aide des filtres suivants : FITC 480/30 nm (vert) et TRITC 540/25 nm (rouge).

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Résultats

Dans les échantillons de spores autoclavées (SA), 2 × 10³ spores/μl et 1 × 10³ spores/μl ont été détectées à l’aide de billes de comptage et de la méthode de Petroff-Hausser, respectivement (figure 2).

Figure 1 : Schéma général de quantification des spores. (A

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Discussion

Les méthodes traditionnelles, telles que le comptage sur plaque des colonies, prennent non seulement du temps, mais nécessitent également des cellules viables et ne permettent pas de quantifier les spores inactivées⁵. La chambre Petroff-Hausser est une méthodologie alternative, mais elle nécessite un microscopiste expérimenté pour la réaliser. La cytométrie en flux s’est avérée être une alternative utile à cette fin.

Genovese et ^al.12

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(N-hydroxysuccinimide) (NHS)	Sigma	130672
Anti-human fluorescent antibody	BioLegend	501410	APC anti-human IL-10
Anti-mouse fluorescent antibody	Thermo Scientific	A32723	Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II	BD		Flow cytometer
BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x)	BD	642412	Quality control reagent
BD FACSDiva Software v. 6.1.3	BD	643629	Software
Centrifuge MegaFuge 8R	Thermo Scientific	75007213
Counting Beads	BD	340334	TruCount Tubes
Eclipse 80i	Nikon		Fluorescent Microsope
Ethidium Bromide	Ludwig Biotec
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	A4503
Plastic Microtubes	Eppendorf
Polystyrene tube	Falcon	352008	5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile