CRISPR-Cas9 Genom-Editierung von Rattenembryonen mit Hilfe des Adeno-assoziierten Virus (AAV) und der Elektroporation von 2-Zell-Embryonen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt einen optimierten Ansatz zur Herstellung genetisch veränderter Rattenmodelle dar. Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wird verwendet, um eine DNA-Reparaturvorlage zu liefern, und die Elektroporation wird verwendet, um CRISPR-Cas9-Reagenzien zu verabreichen, um den Genom-Editierungsprozess im 2-Zell-Embryo abzuschließen.

Zusammenfassung

Die Genom-Editing-Technologie wird häufig eingesetzt, um genetisch veränderte Tiere, einschließlich Ratten, zu züchten. Die zytoplasmatische oder pronukleäre Injektion von DNA-Reparaturschablonen und CRISPR-Cas-Reagenzien ist die häufigste Verabreichungsmethode in Embryonen. Diese Art der Mikromanipulation erfordert jedoch den Zugang zu spezialisierten Geräten, ist mühsam und erfordert ein gewisses Maß an technischem Geschick. Darüber hinaus führen Mikroinjektionstechniken aufgrund der mechanischen Belastung des Embryos oft zu einer geringeren Überlebensrate des Embryos. In diesem Protokoll haben wir eine optimierte Methode entwickelt, um große DNA-Reparaturschablonen zu liefern, die in Verbindung mit der CRISPR-Cas9-Genom-Editierung arbeiten, ohne dass eine Mikroinjektion erforderlich ist. Dieses Protokoll kombiniert die AAV-vermittelte DNA-Verabreichung von einzelsträngigen DNA-Spendervorlagen mit der Verabreichung von CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein (RNP) durch Elektroporation, um 2-Zell-Embryonen zu modifizieren. Mit dieser neuartigen Strategie haben wir erfolgreich gezielte Knock-in-Rattenmodelle hergestellt, die DNA-Sequenzen mit einer Größe von 1,2 bis 3,0 kb mit Wirkungsgraden zwischen 42 % und 90 % einfügen.

Einleitung

Die Entwicklung von CRISPR-basierten Genom-Editierungswerkzeugen hat unsere Fähigkeit beschleunigt, neue und anspruchsvollere gentechnisch veränderte Rattenmodelle effizient zu erstellen. Single-guide-RNA wird zusammen mit Cas9-Nuklease kombiniert, um Ribonukleoprotein-Komplexe (RNP) zu bilden, die auf DNA-Sequenzen von Interesse innerhalb des Genoms abzielen und zu doppelsträngigen DNA-Brüchen führen. Da zelluläre DNA-Reparaturmechanismen fehleranfällig sind, werden während des Reparaturprozesses Insertionen und Deletionen (INDELs) eingeführt, die die Funktion eines Zielgens stören können. Wenn eine gewünschte modifizierte DNA-Sequenz (Reparatur-Matrize) zusammen mit....

Protokoll

Alle Versuchsverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Missouri (ACUC-Protokoll #25580) genehmigt und gemäß den Richtlinien des Leitfadens für die Verwendung und Pflege von Labortieren durchgeführt.

1. AAV-vermittelte Lieferung von DNA-Reparaturschablonen

1. Entwerfen Sie das DNA-Konstrukt so, dass es die gewünschte Knock-in-Sequenz zwischen zwei Homologiearmen enthält. Typische Homologie-Armlängen sind 300-500 bp lang. Stellen Sie sicher, dass das gesamte DNA-Reparatur-Template (Homologiearme + gewünschte Knock-in-Sequenz) von invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs) fla....

Ergebnisse

Gemäß dem Protokoll gibt es eine effektive AAV-vermittelte Verabreichung der DNA-Reparaturvorlage, die eine hocheffiziente HDR ermöglicht, nachdem 2-Zell-Embryonen mit CRISPR-Cas9-RNPs elektroporiert wurden. Wie im Video gezeigt, führt ein erfolgreicher Elektroporationsprozess dazu, dass sich auf jeder Elektrode Blasen bilden (Abbildung 2C) und die Impedanz im Bereich von 0,100 und 0,300 kΩ bleibt. Nach der Elektroporation ist es nicht ungewöhnlich, das.......

Diskussion

Das Genom-Editing-System CRISPR-Cas hat die Gentechnik revolutioniert, indem es die effiziente Herstellung sowohl einfacher als auch komplexer, maßgeschneiderter genetischer Veränderungen in einer Vielzahl von Tierarten ermöglicht. Häufige Verfeinerungen und Verbesserungen der Techniken im Zusammenhang mit der Genom-Editierung erhöhen seine Vielseitigkeit. Hier haben wir einen neuen Ansatz beschrieben, der die ssAAV-vermittelte DNA-Verabreichung zusammen mit der Elektroporation von 2-Zell-Embryonen von CRISPR-Cas9-R.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leads with alligator clips for electrodes	NepaGene	C117
Mineral oil	MilliporeSigma	M5310
NepaGene21 Super Electroporator	NepaGene	NEPA21
Platinum plate electrodes on slide glass	NepaGene	CUY501P1-1.5
PURedit Cas9 Protein	MilliporeSigma	PECAS9
sgRNA (chemically-modified)	Synthego	N/A
ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template	Vectorbuilder	N/A