CRISPR-Cas9 Edição Genômica de Embriões de Rato usando Vírus Adenoassociado (AAV) e Eletroporação de Embriões de 2 Células

Resumo

Este protocolo apresenta uma abordagem otimizada para a produção de modelos de ratos geneticamente modificados. O vírus adenoassociado (AAV) é usado para entregar um modelo de reparo de DNA, e a eletroporação é usada para entregar reagentes CRISPR-Cas9 para completar o processo de edição do genoma em embrião de 2 células.

Resumo

A tecnologia de edição do genoma é amplamente utilizada para produzir animais geneticamente modificados, incluindo ratos. A injeção citoplasmática ou pronuclear de moldes de reparo de DNA e reagentes CRISPR-Cas é o método de liberação mais comum em embriões. No entanto, esse tipo de micromanipulação requer acesso a equipamentos especializados, é trabalhoso e requer um certo nível de habilidade técnica. Além disso, as técnicas de microinjeção frequentemente resultam em menor sobrevivência do embrião devido ao estresse mecânico sobre o embrião. Neste protocolo, desenvolvemos um método otimizado para entregar grandes modelos de reparo de DNA para trabalhar em conjunto com a edição do genoma CRISPR-Cas9 sem a necessidade de microinjeção. Este protocolo combina a entrega de DNA mediada por AAV de modelos de doadores de DNA de fita simples juntamente com a entrega de ribonucleoproteína CRISPR-Cas9 (RNP) por eletroporação para modificar embriões de 2 células. Usando esta nova estratégia, produzimos com sucesso modelos de ratos knock-in direcionados carregando a inserção de sequências de DNA de 1,2 a 3,0 kb de tamanho com eficiências entre 42% e 90%.

Introdução

O desenvolvimento de ferramentas de edição do genoma baseadas em CRISPR acelerou nossa capacidade de gerar eficientemente novos e mais sofisticados modelos de ratos geneticamente modificados. O RNA guia-único, juntamente com a nuclease Cas9, é combinado para formar complexos de ribonucleoproteína (RNP) que têm como alvo sequências de DNA de interesse dentro do genoma e resultam em quebras de DNA de fita dupla. Como os mecanismos de reparo do DNA celular são propensos a erros, inserções e deleções (INDELs) são introduzidas durante o processo de reparo que podem interromper a função de um gene alvo. Quando há co-entrega de uma sequência de DNA projetada desejada (modelo de reparo) juntamente com reagentes de edição do genoma, a inserção do molde de reparo na região que contém a quebra de DNA de fita dupla ocorre por meio de um processo chamado reparo dirigido por homologia (HDR). Esta é uma estratégia eficaz para gerar modelos animais com inserções/substituições de DNA direcionadas (knock-ins). Uma limitação é que as sequências knock-in são frequentemente grandes em tamanho, o que demonstrou reduzir a eficiência da edição gênica, tornando a geração do modelo desejado mais difícil¹. Estratégias para aumentar a eficiência do knock-in incluíram a linearização de modelos de reparo de DNA de fita dupla (dsDNA) e DNA de fita simples (ssDNA) e modificação química de modelos de reparo de DNA ^2,3,4. Além disso, a microinjeção pronuclear juntamente com compostos estimuladores de HDR, a aplicação de pulsos elétricos em conjunto com a microinjeção e a microinjeção cronometrada em embriões de 2 células têm sido tentadas ^5,6,7. Apesar do sucesso de algumas dessas abordagens, a incorporação de sequências de DNA maiores que 1,0 kb permanece tecnicamente desafiadora.

A eletroporação, que é um método comum para introduzir reagentes em linhagens celulares cultivadas, oferece uma alternativa à microinjeção para a entrega de componentes CRISPR-Cas9 em embriões. A eletroporação embrionária, demonstrada pela primeira vez em embriões de ratos⁸, tem sido utilizada com sucesso como método de liberação em camundongos 9,10,11,12,13, suínos ^14,15 e outros organismos animais^modelo 16,17,18 . Os embriões, suspensos no meio contendo reagentes CRISPR-Cas9, são colocados em uma cubeta ou em uma lâmina de vidro entre dois eletrodos e submetidos a pulsos diretos de correntes elétricas. Isso cria aberturas transitórias na zona pelúcida e na membrana plasmática do embrião através das quais os componentes CRISPR-Cas9 entram nos embriões. Normalmente, pulsos elétricos de "poring" de nível médio são usados para criar as aberturas temporárias seguidas por "pulsos de transferência" elétricos de nível inferior que facilitam o movimento dos componentes de edição do genoma carregados negativamente. A eletroporação embrionária é eficiente, tem alto rendimento e é fácil de executar. No entanto, embora a eletroporação embrionária tenha se mostrado altamente bem-sucedida para a introdução de pequenos (^<200 pb) modelos de reparo de ssDNA, há poucos relatos de eletroporação bem-sucedida de modelos de reparo maiores (^>1,0 kb)^13,19. Essa restrição de tamanho representa uma grande limitação da eletroporação embrionária por gerar modelos animais knock-in que requerem grandes inserções.

No contexto da terapia gênica, os vírus adenoassociados (AAVs) têm sido usados há muito tempo como veículos para liberar material genético devido à sua eficiente infectividade in vivo de células em divisão e não em divisão, ausência de patogenicidade e rara integração genômica^20,21. Recentemente, mais estudos combinaram AAVs com a tecnologia CRISPR-Cas9 para introduzir modelos de reparo de DNA e reagentes CRISPR 22,23,24. Essa abordagem permite a entrega de modelos maiores de reparo de DNA sem a necessidade de técnicas de microinjeção.

A via HDR é mais ativa nas fases S tardia e G2 do ciclo^celular25,26. Em estudos realizados in vitro, aumentos significativos na eficiência de knock-in foram alcançados pela entrega de RNPs CRISPR-Cas9 e modelos de reparo de DNA em células sincronizadas com G2 ou pela restrição da presença da proteína Cas9 às fases S e G2 tardias usando uma proteína de fusão Cas9-Geminin². Além disso, há um grande evento de ativação do genoma zigótico (ZGA) que ocorre durante a fase G2 estendida do embrião em estágio de 2 células, e isso está associado a um estado de cromatina aberta. Especula-se que isso proporcione aos RNPs CRISPR-Cas9 e modelos de reparo maior acessibilidade ao DNA genômico.

Nosso objetivo foi desenvolver todas essas observações, combinando a abordagem AAV com eletroporação embrionária para introduzir RNPs CRISPR-Cas9 no estágio de 2 células do desenvolvimento embrionário. Essa estratégia aproveita a maior capacidade de entrega do molde de reparo de DNA do AAV, a facilidade técnica de eletroporação e o ponto de tempo de 2 células mais ideal para acessibilidade genômica durante o desenvolvimento do embrião para criar um método eficiente para engenharia genética direcionada de inserções de DNA. Como destacado neste protocolo, nosso método otimizado permite a produção de modelos de ratos knock-in direcionados carregando inserções de sequências de DNA de 1,2 a 3,0 kb de tamanho sem a necessidade de técnicas de microinjeção.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Missouri (protocolo ACUC #25580) e foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas no Guia para o Uso e Cuidado de Animais de Laboratório.

1. Entrega do modelo de reparo de DNA mediado por AAV

1. Projete a construção de DNA para conter a sequência de knock-in desejada entre dois braços de homologia. Os comprimentos típicos dos braços de homologia são de 300-500 pb de comprimento. Certifique-se de que todo o molde de reparo de DNA (braços de homologia + sequência de knock-in desejada) seja flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) por clonagem em um backbone plasmidial apropriado e empacotamento em ssAAV1 ou ssAAV6 recombinantes (sorotipos 1 ou 6).
   NOTA: Se a sequência alvo do sgRNA estiver presente no modelo de reparo de DNA, é importante projetar mutações silenciosas para interromper essa sequência, impedindo assim a edição mediada por CRISPR-Cas9 do alelo corretamente visado.
   CUIDADO: Os vetores virais AAV recombinantes não são integradores e classificados como BSL-1. Técnicas assépticas padrão são usadas para pipetar e manipular embriões que foram expostos a vírus.
2. Adicionar ssAAV1 ou ssAAV6 projetados (embalados com molde de reparo de DNA) a 30 μL de meio KSOM-R^27,28 para uma concentração final de 3 × 10⁷ cópias do genoma (GC)/μL sob óleo mineral em placa de Petri de 35 mm.
3. Coloque zigotos com pró-núcleos visíveis no meio KSOM-R contendo ssAAV projetado.
   NOTA: Usando este protocolo, não há necessidade de afinar a zona pelúcida, pois os sorotipos 1 e 6 do AAV são capazes de passar prontamente para a entrega eficiente do molde de reparo de DNA.
4. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade máxima durante 18-20 h para permitir uma transdução viral suficiente.

2. Preparação da eletroporação

1. No dia seguinte, fazer uma mistura de eletroporação contendo 100 ng/μL de sgRNA e 100 ng/μL de proteína Cas9 diluída em meio Opti-MEM em um tubo estéril livre de RNase. Misture delicadamente.
2. Incubar à temperatura ambiente por 10 min para permitir a formação da RNP.
3. Durante o tempo de incubação, ligue o eletroporator e conecte os cabos a um eletrodo deslizante de vidro com folga de 1,5 mm.
4. Defina os parâmetros de eletroporação conforme descrito na Tabela 1.

3. Eletroporação embrionária de 2 células

1. Pipetar suavemente 5 μL da mistura de eletroporação CRISPR entre os dois eletrodos na lâmina de vidro, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução.
2. Remova o embrião em estágio de 2 células da solução de AAV. Alinhe embriões em estágio de 2 células na mistura sem permitir que eles toquem nas laterais dos eletrodos. Isso é feito para evitar a lise.
3. Pressione o botão Ohm para medir a impedância. Verifique se a impedância está entre 0,100 e 0,300 kΩ. O volume da reação irá alterar a impedância (adicionar volume para diminuir a impedância e subtrair volume para aumentar a impedância).
4. Pressione Iniciar. O processo leva alguns segundos para ser concluído.
5. Remover os embriões imediatamente após a eletroporação e lavar 3 vezes em gotas frescas de 30 μL do meio KSOM-R.
6. Colocar os embriões novamente em estufa a 37 °C com 5% de CO₂ e umidade máxima para cultivo in vitro em gotas de 500 μL do meio KSOM-R sob óleo mineral. Alternativamente, transfira cirurgicamente embriões para uma rata pseudogestante pós-coito (dpc) de 1,5 dia para produzir descendentes vivos.

Figura 1: Esquema da entrega de DNA mediada por AAV e pipeline de eletroporação embrionária de 2 células para edição do genoma CRISPR-Cas9. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

Seguindo o protocolo, há uma entrega efetiva mediada por AAV do molde de reparo de DNA, permitindo HDR altamente eficiente após embriões de 2 células serem eletroporados com RNPs CRISPR-Cas9. Como mostrado no vídeo, um processo de eletroporação bem-sucedido resulta na formação de bolhas em cada eletrodo (Figura 2C) e a impedância permanece dentro da faixa de 0,100 e 0,300 kΩ. Após a eletroporação, não é incomum que os embriões inchem preenche...

Discussão

O sistema de edição do genoma CRISPR-Cas revolucionou o campo da engenharia genética ao permitir a produção eficiente de modificações genéticas simples e complexas e personalizadas em uma variedade de espécies animais. Refinamentos frequentes e melhorias nas técnicas associadas à edição do genoma aumentam sua versatilidade. Aqui descrevemos uma nova abordagem usando a entrega de DNA mediada por ssAAV juntamente com a eletroporação embrionária de 2 células de reagentes CRISPR-Cas9 em embriões de roedores...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leads with alligator clips for electrodes	NepaGene	C117
Mineral oil	MilliporeSigma	M5310
NepaGene21 Super Electroporator	NepaGene	NEPA21
Platinum plate electrodes on slide glass	NepaGene	CUY501P1-1.5
PURedit Cas9 Protein	MilliporeSigma	PECAS9
sgRNA (chemically-modified)	Synthego	N/A
ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template	Vectorbuilder	N/A