Editing del genoma CRISPR-Cas9 di embrioni di ratto utilizzando il virus adeno-associato (AAV) e l'elettroporazione di embrioni a 2 cellule

Riepilogo

Questo protocollo presenta un approccio ottimizzato per la produzione di modelli di ratto geneticamente modificati. Il virus adeno-associato (AAV) viene utilizzato per fornire un modello di riparazione del DNA e l'elettroporazione viene utilizzata per fornire reagenti CRISPR-Cas9 per completare il processo di editing del genoma nell'embrione a 2 cellule.

Abstract

La tecnologia di editing del genoma è ampiamente utilizzata per produrre animali geneticamente modificati, compresi i ratti. L'iniezione citoplasmatica o pronucleare di modelli di riparazione del DNA e reagenti CRISPR-Cas è il metodo di somministrazione più comune negli embrioni. Tuttavia, questo tipo di micromanipolazione richiede l'accesso ad attrezzature specializzate, è laborioso e richiede un certo livello di abilità tecnica. Inoltre, le tecniche di microiniezione spesso comportano una minore sopravvivenza dell'embrione a causa dello stress meccanico sull'embrione. In questo protocollo, abbiamo sviluppato un metodo ottimizzato per fornire modelli di riparazione del DNA di grandi dimensioni da lavorare in combinazione con l'editing del genoma CRISPR-Cas9 senza la necessità di microiniezioni. Questo protocollo combina la somministrazione di DNA mediata da AAV di modelli di donatori di DNA a singolo filamento con la somministrazione della ribonucleoproteina CRISPR-Cas9 (RNP) mediante elettroporazione per modificare gli embrioni a 2 cellule. Utilizzando questa nuova strategia, abbiamo prodotto con successo modelli mirati di ratto knock-in con inserzione di sequenze di DNA di dimensioni comprese tra 1,2 e 3,0 kb con efficienze comprese tra il 42% e il 90%.

Introduzione

Lo sviluppo di strumenti di editing del genoma basati su CRISPR ha accelerato la nostra capacità di generare in modo efficiente nuovi e più sofisticati modelli di ratti geneticamente modificati. L'RNA a guida singola, insieme alla nucleasi Cas9, viene combinato per formare complessi di ribonucleoproteina (RNP) che prendono di mira le sequenze di DNA di interesse all'interno del genoma e provocano rotture del DNA a doppio filamento. Poiché i meccanismi di riparazione del DNA cellulare sono soggetti a errori, durante il processo di riparazione vengono introdotte inserzioni e delezioni (INDEL) che possono interrompere la funzione di un gene bersaglio. Quando c'è la co-consegna di una sequenza di DNA ingegnerizzato desiderata (modello di riparazione) insieme a reagenti di editing del genoma, l'inserimento del modello di riparazione nella regione contenente la rottura del DNA a doppio filamento avviene attraverso un processo chiamato riparazione diretta dall'omologia (HDR). Si tratta di una strategia efficace per la generazione di modelli animali con inserzioni/sostituzioni mirate di DNA (knock-in). Una limitazione è che le sequenze knock-in sono spesso di grandi dimensioni, il che ha dimostrato di ridurre l'efficienza dell'editing genetico, rendendo così più difficile la generazione del modello desiderato¹. Le strategie per aumentare l'efficienza knock-in hanno incluso la linearizzazione dei modelli di riparazione del DNA a doppio filamento (dsDNA) e del DNA a singolo filamento (ssDNA) e la modifica chimica dei modelli di riparazione del DNA ^2,3,4. Inoltre, sono state tentate la microiniezione pronucleare insieme a composti stimolanti l'HDR, l'applicazione di impulsi elettrici in combinazione con la microiniezione e la microiniezione temporizzata in embrioni a 2 cellule ^5,6,7. Nonostante il successo di alcuni di questi approcci, l'incorporazione di sequenze di DNA più grandi di 1,0 kb rimane tecnicamente impegnativa.

L'elettroporazione, che è un metodo comune per introdurre reagenti in linee cellulari in coltura, offre un'alternativa alla microiniezione per la somministrazione di componenti CRISPR-Cas9 negli embrioni. L'elettroporazione embrionale, dimostrata per la prima volta negli embrioni di ratto⁸, è stata da allora utilizzata con successo come metodo di somministrazione nei topi 9,10,11,12,13, nei suini ^14,15 e in altri organismi modello animali 16,17,18. Gli embrioni, sospesi nel terreno contenente i reagenti CRISPR-Cas9, vengono posti in una cuvetta o su un vetrino tra due elettrodi e sottoposti a impulsi diretti di correnti elettriche. Questo crea aperture transitorie nella zona pellucida e nella membrana plasmatica dell'embrione attraverso le quali i componenti CRISPR-Cas9 entrano negli embrioni. Tipicamente, gli impulsi elettrici di "poring" di medio livello vengono utilizzati per creare le aperture temporanee seguite da "impulsi di trasferimento" elettrici di livello inferiore che facilitano il movimento dei componenti di editing del genoma caricati negativamente. L'elettroporazione embrionale è efficiente, ha un'elevata produttività ed è facile da eseguire. Tuttavia, mentre l'elettroporazione embrionale ha dimostrato di avere un grande successo per l'introduzione di modelli di riparazione di ssDNA di piccole dimensioni (^<200 bp), ci sono poche segnalazioni di successo dell'elettroporazione di modelli di riparazione più grandi (^>1,0 kb)^13,19. Questa restrizione dimensionale rappresenta una delle principali limitazioni dell'elettroporazione embrionale per la generazione di modelli animali knock-in che richiedono grandi inserimenti.

Nel contesto della terapia genica, i virus adeno-associati (AAV) sono stati a lungo utilizzati come veicoli per veicolare materiale genetico grazie alla loro efficiente infettività in vivo delle cellule in divisione e non in divisione, alla mancanza di patogenicità e alla rara integrazione genomica^20,21. Recentemente, altri studi hanno combinato gli AAV con la tecnologia CRISPR-Cas9 per introdurre modelli di riparazione del DNA e reagenti CRISPR 22,23,24. Questo approccio consente la consegna di modelli di riparazione del DNA più grandi senza la necessità di tecniche di microiniezione.

La via HDR è più attiva nelle ultime fasi S e G2 del ciclo cellulare^25,26. Negli studi condotti in vitro, sono stati ottenuti aumenti significativi dell'efficienza knock-in mediante la somministrazione di RNP CRISPR-Cas9 e modelli di riparazione del DNA in cellule sincronizzate con G2 o limitando la presenza della proteina Cas9 alle fasi S e G2 tardive utilizzando una proteina di fusione Cas9-Geminina². Inoltre, c'è un evento di attivazione del genoma zigotico maggiore (ZGA) che si verifica durante la fase G2 estesa dell'embrione allo stadio di 2 cellule, e questo è associato a uno stato di cromatina aperta. Si ipotizza che questo fornisca agli RNP CRISPR-Cas9 e ai modelli di riparazione una maggiore accessibilità al DNA genomico.

Il nostro obiettivo era quello di basarci su tutte queste osservazioni, combinando l'approccio AAV con l'elettroporazione embrionale per introdurre gli RNP CRISPR-Cas9 nella fase a 2 cellule dello sviluppo embrionale. Questa strategia sfrutta la maggiore capacità di rilascio del modello di riparazione del DNA dell'AAV, la facilità tecnica dell'elettroporazione e il punto temporale più ottimale a 2 cellule per l'accessibilità genomica durante lo sviluppo embrionale per creare un metodo efficiente per l'ingegneria genetica mirata delle inserzioni di DNA. Come evidenziato in questo protocollo, il nostro metodo ottimizzato consente la produzione di modelli di ratto knock-in mirati che trasportano inserzioni di sequenze di DNA di dimensioni comprese tra 1,2 e 3,0 kb senza la necessità di tecniche di microiniezione.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Missouri (protocollo ACUC #25580) e sono state eseguite secondo le linee guida stabilite nella Guida per l'uso e la cura degli animali da laboratorio.

1. Somministrazione di modelli di riparazione del DNA mediati da AAV

1. Progettare il costrutto del DNA in modo che contenga la sequenza di knock-in desiderata tra due bracci di omologia. Le lunghezze tipiche dei bracci di omologia sono di 300-500 bp. Assicurarsi che l'intero modello di riparazione del DNA (bracci di omologia + sequenza knock-in desiderata) sia affiancato da ripetizioni terminali invertite (ITR) mediante clonazione in una spina dorsale plasmidica appropriata e impacchettamento in ssAAV1 o ssAAV6 ricombinanti (sierotipi 1 o 6).
   NOTA: Se la sequenza bersaglio dell'sgRNA è presente nel modello di riparazione del DNA, è importante ingegnerizzare mutazioni silenti per interrompere questa sequenza, impedendo così l'editing mediato da CRISPR-Cas9 dell'allele correttamente mirato.
   ATTENZIONE: I vettori virali AAV ricombinanti non sono integranti e classificati come BSL-1. Le tecniche asettiche standard vengono utilizzate per il pipettaggio e la manipolazione degli embrioni che sono stati esposti al virus.
2. Aggiungere ssAAV1 o ssAAV6 ingegnerizzato (confezionato con dima di riparazione del DNA) a 30 μL di terreno KSOM-R^27,28 a una concentrazione finale di 3 × 10 7 copie del genoma (GC)/μL sotto olio minerale in una capsula di Petri da 35 mm.
3. Posizionare gli zigoti con pronuclei visibili nel terreno KSOM-R contenente ssAAV ingegnerizzato.
   NOTA: Utilizzando questo protocollo non è necessario assottigliare la zona pellucida poiché i sierotipi AAV 1 e 6 sono in grado di passare prontamente attraverso per un'efficiente somministrazione del modello di riparazione del DNA.
4. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ e umidità massima per 18-20 ore per consentire una sufficiente trasduzione virale.

2. Preparazione all'elettroporazione

1. Il giorno seguente, preparare una miscela di elettroporazione contenente 100 ng/μL di sgRNA e 100 ng/μL di proteina Cas9 diluiti in terreni Opti-MEM in una provetta sterile priva di RNasi. Mescolare delicatamente.
2. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire la formazione di RNP.
3. Durante il tempo di incubazione, accendere l'elettroporatore e collegare i cavi a un elettrodo vetrino con interasse di 1,5 mm.
4. Impostare i parametri di elettroporazione come descritto nella Tabella 1.

3. Elettroporazione embrionale a 2 cellule

1. Pipettare delicatamente 5 μL della miscela di elettroporazione CRISPR tra i due elettrodi sul vetrino facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella soluzione.
2. Rimuovere l'embrione allo stadio di 2 cellule dalla soluzione di AAV. Allineare gli embrioni allo stadio di 2 cellule nella miscela senza permettere loro di toccare i lati degli elettrodi. Questo viene fatto per evitare la lisi.
3. Premere il pulsante Ohm per misurare l'impedenza. Verificare che l'impedenza sia compresa tra 0.100 e 0.300 kΩ. Il volume di reazione altererà l'impedenza (aggiungere volume per diminuire l'impedenza e sottrarre volume per aumentare l'impedenza).
4. Premere Avvio. Il processo richiede pochi secondi per essere completato.
5. Prelevare gli embrioni subito dopo l'elettroporazione e lavarli 3 volte in gocce fresche da 30 μL di terreno KSOM-R.
6. Riporre gli embrioni in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO₂ e la massima umidità per la coltura in vitro in gocce da 500 μL di terreno KSOM-R sotto olio minerale. In alternativa, trasferire chirurgicamente gli embrioni in un ratto femmina pseudogravida post coito (dpc) di 1,5 giorni per produrre prole viva.

Figura 1: Schema della somministrazione di DNA mediato da AAV e della pipeline di elettroporazione dell'embrione a 2 cellule per l'editing del genoma CRISPR-Cas9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Seguendo il protocollo, c'è un'efficace somministrazione mediata da AAV del modello di riparazione del DNA che consente un HDR altamente efficiente dopo che gli embrioni a 2 cellule sono stati elettroporati con RNP CRISPR-Cas9. Come mostrato nel video, un processo di elettroporazione riuscito provoca la formazione di bolle su ciascun elettrodo (Figura 2C) e l'impedenza rimane nell'intervallo compreso tra 0,100 e 0,300 kΩ. Dopo l'elettroporazione non è raro...

Discussione

Il sistema di editing genomico CRISPR-Cas ha rivoluzionato il campo dell'ingegneria genetica consentendo la produzione efficiente di modificazioni genetiche personalizzate sia semplici che complesse in una varietà di specie animali. I frequenti perfezionamenti e miglioramenti nelle tecniche associate all'editing del genoma ne aumentano ulteriormente la versatilità. Qui abbiamo descritto un nuovo approccio che utilizza la somministrazione di DNA mediata da ssAAV insieme all'elettroporazione embrionale a 2 cellule dei re...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leads with alligator clips for electrodes	NepaGene	C117
Mineral oil	MilliporeSigma	M5310
NepaGene21 Super Electroporator	NepaGene	NEPA21
Platinum plate electrodes on slide glass	NepaGene	CUY501P1-1.5
PURedit Cas9 Protein	MilliporeSigma	PECAS9
sgRNA (chemically-modified)	Synthego	N/A
ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template	Vectorbuilder	N/A