Kationische Nanoemulsions-verkapselte Retinsäure als Adjuvans zur Förderung von OVA-spezifischen systemischen und mukosalen Reaktionen

Zusammenfassung

In diesem Protokoll haben wir eine mit einer kationischen Nanoemulsion verkapselte Retinsäure (RA) entwickelt, die als Adjuvans verwendet werden kann, um antigenspezifische systemische und mukosale Reaktionen zu fördern. Durch die Zugabe der von der FDA zugelassenen RA zur Nanoemulsion wurde antigenspezifisches sIgA in der Vagina und im Dünndarm nach intramuskulärer Injektion der Nanoemulsion gefördert.

Zusammenfassung

Kationische Nanostrukturen haben sich als adjuvans- und Antigenabgabesystem herausgestellt, das die Reifung dendritischer Zellen, die ROS-Erzeugung und die Antigenaufnahme verbessert und dann antigenspezifische Immunantworten fördert. In den letzten Jahren hat Retinsäure (RA) aufgrund ihrer Wirkung bei der Aktivierung der Immunantwort der Schleimhaut zunehmend Aufmerksamkeit erhalten. Um RA jedoch als Schleimhautadjuvans zu verwenden, ist es notwendig, das Problem seiner Auflösung, Belastung und Abgabe zu lösen. Hier beschreiben wir ein kationisches Nanoemulsions-verkapseltes Retinsäure-Verabreichungssystem (CNE-RA), das aus dem kationischen Lipid 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOTAP), Retinsäure, Squalen als Ölphase, Polysorbat 80 als Tensid und Sorbitantrioleat 85 als Co-Tensid besteht. Seine physikalischen und chemischen Eigenschaften wurden mit Hilfe von dynamischer Lichtstreuung und einem Spektralphotometer charakterisiert. Die Immunisierung von Mäusen mit der Mischung aus Antigen (Ovalbumin, OVA) und CNE-RA erhöhte signifikant die Spiegel von anti-OVA-sekretorischem Immunglobulin A (sIgA) in der vaginalen Spülflüssigkeit und der Dünndarmspülung von Mäusen im Vergleich zu OVA allein. Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Vorbereitung, Charakterisierung und Bewertung der adjuvanten Wirkung von CNE-RA.

Einleitung

Adjuvantien werden häufig eingesetzt, um die Wirksamkeit eines Impfstoffs zu erhöhen, indem sie das Immunsystem dazu anregen, stärker auf den Impfstoff zu reagieren, wodurch die Immunität gegen einen bestimmten Erreger erhöht^{wird 1}. Nanoemulsion (NE)-Adjuvans bezieht sich auf ein kolloidales Dispersionssystem mit thermodynamischer Stabilität, indem es einen bestimmten Anteil der Ölphase und der wässrigen Phase emulgiert, um eine Emulsion in Form von Wasser-in-Öl (W/O) oder Öl-in-Wasser (O/W)² zu erzeugen. O/W-Nanoemulsions-Adjuvans können Zytokine und Chemokine an der Injektionsstelle produzieren, die schnelle Aggregatio....

Protokoll

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Verwendung und Pflege von Labortieren durchgeführt und von der Kommission für den Schutz und die Ethik von Versuchstieren der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt.

1. Herstellung von Nanoemulsionen (NEs)

1. Für die Herstellung in der wässrigen Phase werden 0,15 g Polysorbat 80 in 28,2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter Rühren bei 40 °C gelöst.
2. Für die Vorbereitung der Ölphase ist die Ölphasenformulierung der Nanoemulsion zu verwenden, die in Tabelle 1 gezeigt ist. Das Sornitantrileat 85, DOTAP ....

Diskussion

In diesem Protokoll haben wir eine kationische, in Nanoemulsion verkapselte Retinsäure entwickelt, die als Adjuvans verwendet werden kann, um antigenspezifische systemische und mukosale Reaktionen zu fördern. Im Vergleich zu herkömmlichen NE-Adjuvantien hat es die folgenden zwei Vorteile. Erstens weist die Oberfläche von O/W NEs im Allgemeinen eine hohe negative Ladung auf, was es schwierig macht, Antigene direkt zu laden. Kationische NEs können Peptid- oder Proteinantigene effektiv adsorbieren und die spezifische I.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1640 medium	GIBCO, USA	C11875500BT
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab171529-1000 mL
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BSA	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
Danamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer Nano S90
DOTAP	CordenPharma, Switzerland	O02002
ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)	mabtech	ab205719
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)	Abcam	ab97240-1mg
Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)	Abcam	ab97235-1mg
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)	Abcam	Ab205720-500ug
Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)	Abcam	ab97245-1mg
High pressure homogenizer	ATS
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
OVA323-339	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Phosphate buffer saline	ZSGB-bio	ZLI-9061
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
retinoic acid	TCI, Japan	TCI-R0064-5G
Squalene	Sigma, USA	S3626
T10 basic Ultra-Turrax	IKA, Germany
TMB ELISA Substrate	Abcam	ab171523-1000ml
trypsin inhibitor	Diamond	A003570-0100
Tween-20	Macklin, China	9005-64-5
Ultraviolet spectrophotometer	Hitachi	U-3900