Ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do OVA

Resumo

Neste protocolo, desenvolvemos um ácido retinóico (AR) encapsulado em nanoemulsão catiônica para ser usado como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do antígeno. Ao adicionar o RA aprovado pela FDA à nanoemulsão, a sIgA específica do antígeno foi promovida na vagina e no intestino delgado após a injeção intramuscular da nanoemulsão.

Resumo

As nanoestruturas catiônicas surgiram como um adjuvante e sistema de entrega de antígenos que aumenta a maturação das células dendríticas, a geração de ROS e a captação de antígenos e, em seguida, promove respostas imunes específicas do antígeno. Nos últimos anos, o ácido retinóico (AR) tem recebido atenção crescente devido ao seu efeito na ativação da resposta imune da mucosa; no entanto, para usar a AR como adjuvante da mucosa, é necessário resolver o problema de sua dissolução, carregamento e entrega. Aqui, descrevemos um sistema de entrega de ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica (CNE-RA) composto pelo lipídio catiônico 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOTAP), ácido retinóico, esqualeno como fase oleosa, polissorbato 80 como surfactante e trioleato de sorbitano 85 como co-surfactante. Suas propriedades físicas e químicas foram caracterizadas usando espalhamento dinâmico de luz e um espectrofotômetro. A imunização de camundongos com a mistura de antígeno (ovalbumina, OVA) e CNE-RA elevou significativamente os níveis de imunoglobulina A secretora anti-OVA (sIgA) no fluido de lavagem vaginal e no fluido de lavagem do intestino delgado de camundongos em comparação com OVA sozinho. Este protocolo descreve um método detalhado para a preparação, caracterização e avaliação do efeito adjuvante do CNE-RA.

Introdução

Os adjuvantes são frequentemente usados para aumentar a eficácia de uma vacina, estimulando o sistema imunológico a responder mais fortemente à vacina, aumentando assim a imunidade a um patógeno específico¹. O adjuvante de nanoemulsão (NE) refere-se a um sistema de dispersão coloidal com estabilidade termodinâmica, emulsificando uma certa proporção da fase oleosa e da fase aquosa para produzir uma emulsão na forma de água em óleo (A/O) ou óleo em água (O/A)². O adjuvante de nanoemulsão O/A pode produzir citocinas e quimiocinas no local da injeção, induzir a rápida agregação e proliferação de células imunes importantes, como monócitos, neutrófilos e eosinófilos, e aumentar a resposta imune e melhorar a imunogenicidade dos antígenos³. Atualmente, três adjuvantes de nanoemulsão (MF59, AS03 e AF03) foram licenciados para uso em vacinas e têm demonstrado boa segurança e eficácia⁴.

No entanto, a imunidade da mucosa tem sido pouco abordada pelas formulações adjuvantes atualmente licenciadas na vacinação parenteral convencional⁵. Foi relatado que o ácido retinóico (AR) induz o homing intestinal das células imunes, mas sua baixa polaridade, baixa solubilidade em água e baixa estabilidade térmica e luminosa limitam seu uso para vacinação entérica robusta. As nanoemulsões oferecem oportunidades para aumentar a biodisponibilidade de medicamentos altamente lipofílicos, e o núcleo de óleo dos adjuvantes de emulsão O/A é adequado para dissolver substâncias apolares, como o RA⁶. Portanto, as nanoemulsões podem ser usadas como carreadores para AR, a fim de alcançar o efeito de resposta dupla da imunidade sistêmica e da imunidade da mucosa.

Em comparação com os sistemas de entrega neutros ou aniônicos, os sistemas de entrega catiônica têm capacidades relativamente eficientes de encapsulamento e entrega de antígenos, o que pode aumentar a imunogenicidade dos antígenos ^7,8,9. A carga de superfície catiônica de uma variedade de sistemas adjuvantes é importante para seus efeitos adjuvantes 10,11,12. A carga catiônica é um fator importante no prolongamento da retenção da vacina no local da injeção, aumentando a apresentação do antígeno e prolongando a estimulação da imunidade celular no organismo¹².

Com base nas considerações acima, desenvolvemos uma nanoemulsão catiônica para co-fornecer efetivamente RA e antígenos. O tamanho de partícula e o potencial zeta da nanoemulsão foram determinados usando espalhamento dinâmico de luz (DLS), e as respostas imunes sistêmicas e mucosas da nanoemulsão combinada com OVA foram avaliadas por injeção intramuscular¹³.

Protocolo

Os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Uso e Cuidados com Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar de Animais de Laboratório da Terceira Universidade Médica Militar.

1. Preparação de nanoemulsões (EN)

1. Para a preparação da fase aquosa, dissolver 0,15 g de polissorbato 80 em 28,2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), agitando a 40 °C.
2. Para a preparação da fase oleosa, use a formulação da fase oleosa da nanoemulsão mostrada na Tabela 1. Dissolver o trileato de sornitano 85, DOTAP e RA em esqualeno, agitando a 40 °C.
3. Para a preparação primária da emulsão O/A, agite a fase oleosa magneticamente a 1400 rpm enquanto adiciona o aquoso lentamente e gota a gota a uma taxa de 1 mL/min. Pré-emulsione a mistura usando um emulsificante de alto cisalhamento a 30.000 rpm por 6 min.
4. Para homogeneização de alta pressão (HPH), trate a emulsão O/A primária preparada acima com um homogeneizador de alta pressão por 12 ciclos a 900 bar para obter uma nanoemulsão homogênea na faixa de 160-190 nm.
5. No final do processo, recolher a emulsão num balão de 50 ml e filtrar-esterilizar a emulsão através de uma membrana filtrante PES de 0,2 μm.
6. Conecte o frasco à Linha Schlenk através do cateter, girando a torneira de três vias para conectar o sistema ao tubo de vácuo e ligue a bomba de vácuo para criar vácuo no frasco. Em seguida, girando a torneira de três vias, conecte o sistema ao tubo de argônio e encha-o com argônio. Repita esta etapa 3x para garantir que o frasco esteja cheio de argônio.
7. Substituir a rolha e selar com uma película de parafina, envolver o balão em folha de estanho e conservá-lo a 4 °C.

2. Caracterização das nanoemulsões

1. Tamanho de partícula e detecção de potencial zeta
   1. Ligue o instrumento e aguarde 30 minutos para que a fonte de luz laser se estabilize.
   2. Dilua o NE 50 vezes com água ultrapura e adicione 1 mL de amostra à célula de amostra correspondente.
   3. Para medir o tamanho das partículas, defina a temperatura para 25 °C, selecione água como meio de dispersão e selecione pratos de plástico descartáveis como célula de medição. Carregue as amostras e meça automaticamente. Relate o valor médio de três medições repetidas para cada amostra como resultado final.
   4. Para medição do potencial zeta, ajuste a temperatura para 25 °C. Devido à escolha da fase aquosa como meio de dispersão, selecione o modelo de Smoluchowsi e a célula capilar dobrada como célula de medição. Carregue as amostras e meça automaticamente. Relate a média de três medições replicadas para cada amostra como resultado final.
2. Determinação da taxa de encapsulamento e taxa de carga de fármacos
   1. Para determinar a quantidade de AR carregada no NE, use etanol absoluto para desemulsionar e extrair o AR do NE. Adicionar 995 μl de etanol a 5 μl de amostra e determinar o teor de AR da solução com um espectrofotómetro a 355 nm. Compare a absorbância com uma curva padrão. Use a seguinte equação:
      Encapsulamento = carga real de AR/peso do medicamento adicionado
      Taxa de carregamento de medicamentos = carregamento real de RA / qualidade da amostra

3. Procedimentos de imunização e coleta de amostras

1. Procedimento e agrupamento de imunização
   1. Agrupe camundongos Balb/C fêmeas com idade entre 6 e 8 semanas e pesando aproximadamente 18-21 g em séries de 5 para imunização no dia 0, dia 14, dia 28 de acordo com os seguintes grupos experimentais: (1) grupo PBS, (2) grupo ovalbumina (OVA), (3) grupo OVA+ NE-RA (OVA/NE-RA), (4) grupo OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA).
   2. Imunizar todos os camundongos por injeção intramuscular nos músculos superiores do quadríceps com 200 μL de diferentes formulações de vacinas: 100 μL de emulsão e 15 μg de OVA absorvidos em 100 μL de PBS, misturados antes da administração. Injetar 100 μL/pata traseira. Para camundongos do grupo controle, administre PBS sozinho.
   3. Eutanásia: Eutanásia de todos os camundongos por uma injeção intraperitoneal de 100 mg / kg de pentobarbital sódico a 1% 2 semanas após a conclusão das três imunizações.
   4. Coleta e processamento de amostras: Após a eutanásia, use uma tesoura para abrir o peito dos camundongos e insira uma seringa diretamente no coração para aspirar aproximadamente 0,5 mL de sangue total. Deixe o sangue repousar por 2 h em temperatura ambiente e, em seguida, centrifugue a 1800 x g por 5 min a 4 ° C. Colher o soro, a alíquota e conservar a -80 °C para análise posterior.
   5. Colete sangue total, baço, fluido de lavagem vaginal (VLF), fluido de lavagem broncoalveolar (BALF), fluido de lavagem nasal (NLF) e fluido de lavagem do intestino delgado (SILF).
2. Isolamento de linfócitos esplênicos
   1. Mergulhe os camundongos em etanol 75% (v / v) para uma breve esterilização, transfira os camundongos para uma bancada limpa. Corte a pele do abdômen esquerdo com uma tesoura, exponha e remova o baço.
   2. Colocar o baço numa placa de Petri contendo 3 ml de PBS, triturar e filtrar para um tubo de centrifugação de 15 ml, utilizando um coador (200 mesh, 70 μm) e uma vareta de moagem.
   3. Centrifugue as células a 650 x g por 5 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e suspenda o precipitado com 3 mL de solução de lise de glóbulos vermelhos, incube em temperatura ambiente por 5 min.
   4. Adicione 10 mL de PBS ao tubo e agite bem para encerrar a reação, depois centrifugue a 650 x g por 5 min em temperatura ambiente.
   5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mL de PBS, adicione 20 μL da diluição celular ao contador de células automatizado para contagem de células.
   6. Centrifugue as células a 650 x g por 5 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e dilua as células para 1 x 10⁶ células / mL com meio completo 1640 (penicilina-estreptomicina, soro bovino fetal a 10%).
3. Coleta de VLF: Enxágue a vagina 4x com 75 μL de 1% BSA / PBST, combine a solução de lavagem e colete em tubos de centrífuga de 1,5 mL, centrifugue a 5000 x g a 4 ° C por 20 min e colete o sobrenadante com uma pipeta e armazene a -80 ° C.
4. Coleção BALF e NLF
   1. Desinfetar os camundongos após o sacrifício com etanol a 75% (v/v). Segure a barriga do mouse para cima e endireite o pescoço. Use uma tesoura para fazer uma incisão longitudinal na pele do pescoço do camundongo e use uma pinça para separar os músculos e expor a traqueia adequadamente.
   2. Corte a traqueia através de uma pequena abertura transversal e insira a mangueira em direção aos pulmões, conecte a seringa à mangueira e injete 0,5 mL de PBS nos pulmões e retire, repita o enxágue 3x e centrifugue a 650 x g a 4 ° C por 5 min, armazene o sobrenadante (BALF) a -80 ° C.
   3. Inverta a mangueira para a cavidade nasal, conecte a seringa à mangueira e injete 0,5 mL de PBS, o líquido fluirá através da cavidade nasal para o tubo de centrífuga de 1,5 mL. Aspirar a lavagem do tubo de centrifugação e repetir o enxaguamento 2x, depois centrifugar a 650 x g a 4 °C durante 5 min, conservar o sobrenadante (NLF) a -80 °C.
5. Coleção SILF
   1. Prepare a solução de PBS contendo 0,1 mg / mL de inibidor de tripsina, 50 mM / L EDTA-2Na, 1 mM / L de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) como solução de lavagem do intestino delgado. Agitar à temperatura ambiente para dissolver e conservar a 4 °C.
   2. Corte o intestino delgado ao longo do tubo intestinal e mergulhe em 3 mL de fluido de lavagem do intestino delgado. Misturar por agitação vertical a 15 rpm durante 30 min a 4 °C. Centrifugar a 1440 x g a 4 °C durante 20 min e recolher o sobrenadante com uma pipeta, depois centrifugar a 5000 x g a 4 °C durante 20 min. Conservar o sobrenadante (SILF) a -80 °C.

4. Avaliação da resposta de anticorpos específicos para OVA após administração intramuscular

1. Determinar os níveis séricos de IgG, subclasses de IgG1, IgG2a e os níveis de sIgA específica em VLF, BALF, NLF e SILF por ensaio imunoenzimático (ELISA).
2. Para o revestimento de antígeno, diluir o OVA a 5 μg/mL com tampão de revestimento e revestir placas ELISA de 96 poços durante a noite a 4 °C com 100 μL de solução OVA por alvéolo.
3. Lave as placas ELISA 5x com PBST e bloqueie por incubação com 250 μL de 1% BSA / PBST a 37 ° C por 2 h.
4. Lavar as placas ELISA 5x com PBST, adicionar 100 μL da amostra diluída conforme descrito abaixo para ser ensaiada e incubar a 37 °C durante 1 h. Soro diluído, VLF, BALF, NLF com 0,5% BSA/PBST, SILF diluído com 20% de soro fetal de bezerro (FCS)/PBST.
   1. Comece diluindo o soro 1000x usando um procedimento de diluição em duas etapas: dilua 20 μL de soro para 1 mL e, em seguida, dilua 25 μL desse soro diluído para 500 μL. Use esta diluição do soro para detecção de IgG1, IgG2a.
5. Adicione 200 μL do soro diluído a 1000x à primeira fileira da placa revestida e adicione 100 μL de BSA/PBST a 0,5% a todos os poços, exceto a primeira fileira. Transfira 100 μL da primeira linha para a segunda linha e misture 10x com a pipeta. Repita esta etapa até a linha 8 e descarte 100 μL de líquido, o soro de diferentes concentrações foi obtido para a detecção de IgG.
6. Realize uma diluição de 1:1 de BALF, NLF e SILF para detectar IgA. Utilizar o mesmo procedimento de diluição para o VLF que para o soro.
7. Lave as placas ELISA 5x com PBST. Adicionar 100 μL de IgG/IgG1/IgG2a/IgA de cabra conjugada com HRP (diluída a 1:10000 com PBST) aos alvéolos apropriados e incubar a 37 °C durante 40 min.
8. Lave as placas ELISA 5x com PBST, adicione 100 μL de substrato TMB ELISA (altamente sensível) e transfira a placa para um local protegido da luz por 5 min. Adicione imediatamente 100 μL de solução de parada de 450 nm para substrato TMB para interromper a reação.
9. Meça a absorbância (OD) a 450 nm para cada alvéolo e calcule o título de anticorpos tomando 2,1 vezes o valor sérico do camundongo do grupo em branco como valor de resposta positiva.

5. Ensaio ELISpot

1. Siga as diretrizes do ELISpot Plus, use o Mouse IFN-γ (ALP) do kit para realizar os ensaios.
2. Remova a placa da embalagem selada e lave 4x com PBS estéril (200 μL/poço). Condicione a placa com meio completo 1640 (200 μL/poço) e incube por 30 min em temperatura ambiente.
3. Remova o meio e adicione a concentração ajustada de suspensão de linfócitos preparada na etapa 3.2.2 (100 μL / poço) à placa e, em seguida, adicione 100 μL do estímulo, ou seja, 1640 meio completo contendo 20 μg / mL OVA257 ~ 264 ou OVA323 ~ 339 ou 1640 meio completo. Coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO₂ por 48 h. Enrole o prato com papel alumínio para evitar evaporação.
4. Descarte a suspensão da célula e lave a placa 5x com PBS (200 μL/poço). Dilua o anticorpo de detecção (R4-6A2-biotina) para 1 μg / mL em PBS contendo 0,5% de soro fetal de bezerro (PBS-0,5% FCS). Adicione 100 μL / poço e incube por 2 h em temperatura ambiente.
5. Lave a placa como na etapa 5.2. Diluir a estreptavidina-ALP (1:1000) em PBS-0,5%FCS e adicionar 100 μL/poço, incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
6. Lave a placa como na etapa 5.2. Filtre a solução de substrato pronta para uso (BCIP/NBT-plus) através de um filtro de 0,45 μm e adicione 100 μL/poço. Desenvolva-se até que surjam manchas distintas.
7. Pare o desenvolvimento da cor lavando extensivamente em água da torneira, remova o plástico macio e deixe a placa secar.
8. Inspecione e conte pontos em um leitor ELISpot.

6. Análise estatística

1. Analise as diferenças entre os dados de 4 grupos por ANOVA de uma via seguida de comparação múltipla de Tukey pós-teste. Expresse todos os resultados como média ± DP. Valor de p menor que 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

No total, quatro formulações de nanoemulsão foram preparadas e caracterizadas por seu tamanho de partícula (Figura 1), seu potencial zeta e sua eficiência de encapsulação, conforme apresentado na Tabela 2. O tamanho da partícula foi concentrado em torno de 160-190nm e a adição de DOTAP reverteu o potencial Zeta da nanoemulsão. A IgG sérica específica para OVA e seu nível de anticorpos de subgrupo no soro foram detectados 2 semanas após a terceira imunização....

Discussão

Neste protocolo, desenvolvemos um ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica para ser usado como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do antígeno. Comparado aos adjuvantes NE tradicionais, tem as duas vantagens a seguir. Em primeiro lugar, em geral, a superfície das EN O/A tem uma carga negativa elevada, o que dificulta a carga direta dos antigénios. As EN catiônicas podem efetivamente adsorver antígenos peptídicos ou proteicos e aumentar a imunogenicidade específica. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1640 medium	GIBCO, USA	C11875500BT
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab171529-1000 mL
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BSA	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
Danamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer Nano S90
DOTAP	CordenPharma, Switzerland	O02002
ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)	mabtech	ab205719
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)	Abcam	ab97240-1mg
Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)	Abcam	ab97235-1mg
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)	Abcam	Ab205720-500ug
Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)	Abcam	ab97245-1mg
High pressure homogenizer	ATS
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
OVA323-339	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Phosphate buffer saline	ZSGB-bio	ZLI-9061
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
retinoic acid	TCI, Japan	TCI-R0064-5G
Squalene	Sigma, USA	S3626
T10 basic Ultra-Turrax	IKA, Germany
TMB ELISA Substrate	Abcam	ab171523-1000ml
trypsin inhibitor	Diamond	A003570-0100
Tween-20	Macklin, China	9005-64-5
Ultraviolet spectrophotometer	Hitachi	U-3900