Acido retinoico incapsulato con nanoemulsione cationica come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose specifiche per le OVA

Riepilogo

In questo protocollo, abbiamo sviluppato un acido retinoico (RA) incapsulato in nanoemulsione cationica da utilizzare come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose antigene-specifiche. Aggiungendo l'artrite reumatoide approvata dalla FDA alla nanoemulsione, le sIgA antigene-specifiche sono state promosse nella vagina e nell'intestino tenue dopo l'iniezione intramuscolare della nanoemulsione.

Abstract

Le nanostrutture cationiche sono emerse come un adiuvante e un sistema di rilascio dell'antigene che migliora la maturazione delle cellule dendritiche, la generazione di ROS e l'assorbimento dell'antigene e quindi promuove risposte immunitarie antigene-specifiche. Negli ultimi anni, l'acido retinoico (RA) ha ricevuto una crescente attenzione per il suo effetto nell'attivare la risposta immunitaria della mucosa; tuttavia, per utilizzare l'artrite reumatoide come adiuvante della mucosa, è necessario risolvere il problema della sua dissoluzione, carico e consegna. Qui, descriviamo un sistema di rilascio di acido retinoico incapsulato in nanoemulsione cationica (CNE-RA) composto dal lipide cationico 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOTAP), acido retinoico, squalene come fase oleosa, polisorbato 80 come tensioattivo e trioleato di sorbitano 85 come co-tensioattivo. Le sue proprietà fisiche e chimiche sono state caratterizzate utilizzando la diffusione dinamica della luce e uno spettrofotometro. L'immunizzazione dei topi con la miscela di antigene (ovoalbumina, OVA) e CNE-RA ha aumentato significativamente i livelli di immunoglobulina A secretoria anti-OVA (sIgA) nel liquido di lavaggio vaginale e nel liquido di lavaggio dell'intestino tenue dei topi rispetto al solo OVA. Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la preparazione, la caratterizzazione e la valutazione dell'effetto adiuvante di CNE-RA.

Introduzione

Gli adiuvanti sono spesso utilizzati per migliorare l'efficacia di un vaccino stimolando il sistema immunitario a rispondere più fortemente al vaccino, aumentando così l'immunità a un particolare agente patogeno¹. L'adiuvante della nanoemulsione (NE) si riferisce a un sistema di dispersione colloidale con stabilità termodinamica emulsionando una certa proporzione di fase oleosa e fase acquosa per produrre un'emulsione sotto forma di acqua-in-olio (W/O) o olio-in-acqua (O/W)². L'adiuvante di nanoemulsione O/W può produrre citochine e chemochine nel sito di iniezione, indurre la rapida aggregazione e proliferazione di impo....

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la Guida all'uso e alla cura degli animali da laboratorio e approvati dal Comitato per il benessere e l'etica degli animali da laboratorio della Terza Università medica militare.

1. Preparazione di nanoemulsioni (EN)

1. Per la preparazione in fase acquosa, sciogliere 0,15 g di polisorbato 80 in 28,2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) agitando a 40 °C.
2. Per la preparazione in fase oleosa, utilizzare la formulazione in fase oleosa della nanoemulsione mostrata nella Tabella 1. Sciogliere il trileato di sornitano....

Discussione

In questo protocollo, abbiamo sviluppato un acido retinoico incapsulato in nanoemulsione cationica da utilizzare come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose antigene-specifiche. Rispetto ai tradizionali adiuvanti NE, presenta i seguenti due vantaggi. In primo luogo, in generale, la superficie degli O/W EN ha un'elevata carica negativa, che rende difficile caricare direttamente gli antigeni. Le EN cationiche possono adsorbire efficacemente antigeni peptidici o proteici e migliorare l'immunogenicità specifi.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1640 medium	GIBCO, USA	C11875500BT
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab171529-1000 mL
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BSA	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
Danamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer Nano S90
DOTAP	CordenPharma, Switzerland	O02002
ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)	mabtech	ab205719
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)	Abcam	ab97240-1mg
Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)	Abcam	ab97235-1mg
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)	Abcam	Ab205720-500ug
Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)	Abcam	ab97245-1mg
High pressure homogenizer	ATS
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
OVA323-339	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Phosphate buffer saline	ZSGB-bio	ZLI-9061
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
retinoic acid	TCI, Japan	TCI-R0064-5G
Squalene	Sigma, USA	S3626
T10 basic Ultra-Turrax	IKA, Germany
TMB ELISA Substrate	Abcam	ab171523-1000ml
trypsin inhibitor	Diamond	A003570-0100
Tween-20	Macklin, China	9005-64-5
Ultraviolet spectrophotometer	Hitachi	U-3900