Acido retinoico incapsulato con nanoemulsione cationica come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose specifiche per le OVA

Riepilogo

In questo protocollo, abbiamo sviluppato un acido retinoico (RA) incapsulato in nanoemulsione cationica da utilizzare come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose antigene-specifiche. Aggiungendo l'artrite reumatoide approvata dalla FDA alla nanoemulsione, le sIgA antigene-specifiche sono state promosse nella vagina e nell'intestino tenue dopo l'iniezione intramuscolare della nanoemulsione.

Abstract

Le nanostrutture cationiche sono emerse come un adiuvante e un sistema di rilascio dell'antigene che migliora la maturazione delle cellule dendritiche, la generazione di ROS e l'assorbimento dell'antigene e quindi promuove risposte immunitarie antigene-specifiche. Negli ultimi anni, l'acido retinoico (RA) ha ricevuto una crescente attenzione per il suo effetto nell'attivare la risposta immunitaria della mucosa; tuttavia, per utilizzare l'artrite reumatoide come adiuvante della mucosa, è necessario risolvere il problema della sua dissoluzione, carico e consegna. Qui, descriviamo un sistema di rilascio di acido retinoico incapsulato in nanoemulsione cationica (CNE-RA) composto dal lipide cationico 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOTAP), acido retinoico, squalene come fase oleosa, polisorbato 80 come tensioattivo e trioleato di sorbitano 85 come co-tensioattivo. Le sue proprietà fisiche e chimiche sono state caratterizzate utilizzando la diffusione dinamica della luce e uno spettrofotometro. L'immunizzazione dei topi con la miscela di antigene (ovoalbumina, OVA) e CNE-RA ha aumentato significativamente i livelli di immunoglobulina A secretoria anti-OVA (sIgA) nel liquido di lavaggio vaginale e nel liquido di lavaggio dell'intestino tenue dei topi rispetto al solo OVA. Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la preparazione, la caratterizzazione e la valutazione dell'effetto adiuvante di CNE-RA.

Introduzione

Gli adiuvanti sono spesso utilizzati per migliorare l'efficacia di un vaccino stimolando il sistema immunitario a rispondere più fortemente al vaccino, aumentando così l'immunità a un particolare agente patogeno¹. L'adiuvante della nanoemulsione (NE) si riferisce a un sistema di dispersione colloidale con stabilità termodinamica emulsionando una certa proporzione di fase oleosa e fase acquosa per produrre un'emulsione sotto forma di acqua-in-olio (W/O) o olio-in-acqua (O/W)². L'adiuvante di nanoemulsione O/W può produrre citochine e chemochine nel sito di iniezione, indurre la rapida aggregazione e proliferazione di importanti cellule immunitarie come monociti, neutrofili ed eosinofili, migliorare la risposta immunitaria e migliorare l'immunogenicità degli antigeni³. Attualmente, tre adiuvanti di nanoemulsione (MF59, AS03 e AF03) sono stati autorizzati per l'uso nei vaccini e hanno dimostrato una buona sicurezza ed efficacia⁴.

Tuttavia, l'immunità della mucosa è stata scarsamente affrontata dalle formulazioni adiuvanti attualmente autorizzate nella vaccinazione parenterale convenzionale⁵. È stato riportato che l'acido retinoico (RA) induce l'homing intestinale delle cellule immunitarie, ma la sua bassa polarità, la scarsa solubilità in acqua e la scarsa stabilità alla luce e termica ne limitano l'uso per una robusta vaccinazione enterica. Le nanoemulsioni offrono l'opportunità di aumentare la biodisponibilità di farmaci altamente lipofili e il nucleo oleoso degli adiuvanti per emulsioni O/W è adatto per sciogliere sostanze non polari come l'artrite reumatoide⁶. Pertanto, le nanoemulsioni possono essere utilizzate come vettori per l'artrite reumatoide al fine di ottenere il duplice effetto di risposta dell'immunità sistemica e dell'immunità della mucosa.

Rispetto ai sistemi di rilascio neutri o anionici, i sistemi di rilascio cationico hanno capacità di incapsulamento e rilascio dell'antigene relativamente efficienti, che possono migliorare l'immunogenicità degli antigeni ^7,8,9. La carica cationica superficiale di una varietà di sistemi adiuvanti è importante per i loro effetti adiuvanti 10,11,12. La carica cationica è un fattore importante nel prolungare la ritenzione del vaccino nel sito di iniezione, aumentando la presentazione dell'antigene e prolungando la stimolazione dell'immunità cellulare nel corpo¹².

Sulla base delle considerazioni di cui sopra, abbiamo sviluppato una nanoemulsione cationica per co-fornire efficacemente AR e antigeni. La dimensione delle particelle e il potenziale zeta della nanoemulsione sono stati determinati utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS) e le risposte immunitarie sistemiche e mucose della nanoemulsione combinata con OVA sono state valutate mediante iniezione intramuscolare¹³.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la Guida all'uso e alla cura degli animali da laboratorio e approvati dal Comitato per il benessere e l'etica degli animali da laboratorio della Terza Università medica militare.

1. Preparazione di nanoemulsioni (EN)

1. Per la preparazione in fase acquosa, sciogliere 0,15 g di polisorbato 80 in 28,2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) agitando a 40 °C.
2. Per la preparazione in fase oleosa, utilizzare la formulazione in fase oleosa della nanoemulsione mostrata nella Tabella 1. Sciogliere il trileato di sornitano 85, il DOTAP e l'AR nello squalene agitando a 40 °C.
3. Per la preparazione dell'emulsione O/W primaria, agitare magneticamente la fase oleosa a 1400 giri/min aggiungendo l'acquosa lentamente e goccia a una velocità di 1 mL/min. Pre-emulsionare la miscela utilizzando un emulsionante ad alto taglio a 30.000 giri/min per 6 minuti.
4. Per l'omogeneizzazione ad alta pressione (HPH), trattare l'emulsione O/W primaria preparata sopra con un omogeneizzatore ad alta pressione per 12 cicli a 900 bar per ottenere una nanoemulsione omogenea nell'intervallo 160-190 nm.
5. Al termine del processo, raccogliere l'emulsione in un pallone da 50 ml e sterilizzare l'emulsione con filtro attraverso una membrana filtrante in PES da 0,2 μm.
6. Collegare il pallone alla linea Schlenk attraverso il catetere, ruotando il rubinetto a tre vie per collegare il sistema al tubo del vuoto e accendere la pompa del vuoto per creare il vuoto nel pallone. Quindi, ruotando il rubinetto a tre vie, collegare il sistema al tubo di Argon e riempirlo di Argon. Ripetere questo passaggio 3 volte per assicurarsi che il pallone sia pieno di Argon.
7. Rimettere il tappo e sigillare con una pellicola di paraffine, avvolgere il matraccio in un foglio di stagnola e conservarlo a 4 °C.

2. Caratterizzazione delle nanoemulsioni

1. Rilevamento delle dimensioni delle particelle e del potenziale zeta
   1. Accendere lo strumento e attendere 30 minuti affinché la sorgente di luce laser si stabilizzi.
   2. Diluire l'NE 50 volte con acqua ultrapura e aggiungere 1 mL di campione alla cella del campione corrispondente.
   3. Per misurare la dimensione delle particelle, impostare la temperatura a 25 °C, selezionare l'acqua come mezzo di dispersione e selezionare le piastre di plastica monouso come cella di misura. Caricare i campioni e misurare automaticamente. Riportare il valore medio di tre misurazioni ripetute per ciascun campione come risultato finale.
   4. Per la misurazione del potenziale zeta, impostare la temperatura a 25 °C. A causa della scelta della fase acquosa come mezzo di dispersione, selezionare il modello Smoluchowsi e la cella capillare ripiegata come cella di misura. Caricare i campioni e misurare automaticamente. Riportare la media di tre misurazioni replicate per ciascun campione come risultato finale.
2. Determinazione della velocità di incapsulamento e della velocità di carico del farmaco
   1. Per determinare la quantità di AR caricata nel NE, utilizzare etanolo assoluto per demulsificare ed estrarre l'AR dal NE. A 5 μl di campione, aggiungere 995 μl di etanolo e determinare il contenuto di AR della soluzione utilizzando uno spettrofotometro a 355 nm. Confrontare l'assorbanza con una curva standard. Utilizzare la seguente equazione:
      Incapsulamento = carico effettivo di AR/peso del farmaco aggiunto
      Velocità di caricamento del farmaco = carico effettivo di AR / qualità del campione

3. Procedure di immunizzazione e raccolta dei campioni

1. Procedura di immunizzazione e raggruppamento
   1. Gruppo topi Balb/C femmine di età compresa tra 6 e 8 settimane e del peso di circa 18-21 g in set da 5 per l'immunizzazione il giorno 0, il giorno 14, il giorno 28 secondo i seguenti gruppi sperimentali: (1) gruppo PBS, (2) gruppo ovoalbumina (OVA), (3) gruppo OVA+ NE-RA (OVA/NE-RA), (4) gruppo OVA+CNE-RA (OVA/CNE-RA).
   2. Immunizzare tutti i topi mediante iniezione intramuscolare nei muscoli del quadricipite superiore con 200 μL di diverse formulazioni di vaccino: 100 μL di emulsione e 15 μg di OVA assorbiti in 100 μL di PBS, miscelati prima della somministrazione. Iniettare 100 μL/zampa posteriore. Per i topi nel gruppo di controllo, somministrare solo PBS.
   3. Eutanasia: eutanasia di tutti i topi mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di pentobarbital sodico all'1% 2 settimane dopo il completamento delle tre vaccinazioni.
   4. Raccolta ed elaborazione del campione: dopo l'eutanasia, utilizzare le forbici per aprire il torace dei topi e inserire una siringa direttamente nel cuore per aspirare circa 0,5 ml di sangue intero. Lasciare riposare il sangue per 2 ore a temperatura ambiente e poi centrifugare a 1800 x g per 5 minuti a 4 °C. Raccogliere il siero, l'aliquota e conservare a -80 °C per ulteriori analisi.
   5. Raccogliere sangue intero, milza, liquido di lavaggio vaginale (VLF), liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF), liquido di lavaggio nasale (NLF) e liquido di lavaggio dell'intestino tenue (SILF).
2. Isolamento dei linfociti splenici
   1. Immergere i topi in etanolo al 75% (v/v) per una breve sterilizzazione, trasferire i topi su un banco pulito. Tagliare la pelle sull'addome sinistro con le forbici, esporre e rimuovere la milza.
   2. Mettere la milza in una capsula di Petri contenente 3 mL di PBS, macinare e filtrare in una provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando un setaccio (200 mesh, 70 μm) e un'asta di macinazione.
   3. Centrifugare le celle a 650 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e sospendere il precipitato con 3 mL di soluzione di lisi dei globuli rossi, incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
   4. Aggiungere 10 mL di PBS alla provetta e agitare bene per terminare la reazione, quindi centrifugarla a 650 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   5. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 10 mL di PBS, aggiungere 20 μL della diluizione cellulare al contatore cellulare automatico per il conteggio delle cellule.
   6. Centrifugare le celle a 650 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e diluire le cellule a 1 x 10⁶ cellule/mL con 1640 terreno completo (1% penicillina-streptomicina, 10% siero fetale bovino).
3. Raccolta VLF: Sciacquare la vagina 4 volte con 75 μL di 1%BSA/PBST, combinare la soluzione di lavaggio e raccogliere in provette da centrifuga da 1,5 mL, centrifugare a 5000 x g a 4 °C per 20 minuti e raccogliere il surnatante con una pipetta e conservare a -80 °C.
4. Collezione BALF e NLF
   1. Disinfettare i topi dopo il sacrificio con etanolo al 75% (v/v). Tieni il mouse a pancia in su e raddrizza il collo. Usa le forbici per praticare un'incisione longitudinale nella pelle del collo del topo e usa una pinza per separare i muscoli ed esporre adeguatamente la trachea.
   2. Tagliare la trachea attraverso una piccola apertura trasversale e inserire il tubo verso i polmoni, collegare la siringa al tubo e iniettare 0,5 mL di PBS nei polmoni ed estrarre, ripetere il risciacquo 3 volte e centrifugare a 650 x g a 4 °C per 5 minuti, conservare il surnatante (BALF) a -80 °C.
   3. Invertire il tubo nella cavità nasale, collegare la siringa al tubo e iniettare 0,5 ml di PBS, il liquido scorrerà attraverso la cavità nasale nella provetta da centrifuga da 1,5 ml. Aspirare il lavaggio dalla provetta da centrifuga e ripetere il risciacquo 2 volte, quindi centrifugare a 650 x g a 4 °C per 5 min, conservare il surnatante (NLF) a -80 °C.
5. Collezione SILF
   1. Preparare una soluzione di PBS contenente 0,1 mg/mL di inibitore della tripsina, 50 mM/L DI EDTA-2Na, 1 mM/L di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) come soluzione di lavaggio dell'intestino tenue. Mescolare a temperatura ambiente per sciogliere e conservare a 4 °C.
   2. Tagliare l'intestino tenue lungo il tubo intestinale e immergerlo in 3 ml di liquido di lavaggio intestinale tenue. Mescolare agitando verticalmente a 15 giri/min per 30 minuti a 4 °C. Centrifugare a 1440 x g a 4 °C per 20 minuti e raccogliere il surnatante con una pipetta, quindi centrifugare a 5000 x g a 4 °C per 20 minuti. Conservare il surnatante (SILF) a -80 °C.

4. Valutazione della risposta anticorpale specifica per le OVA dopo somministrazione intramuscolare

1. Determinare i livelli sierici di IgG, le sottoclassi di IgG1, IgG2a e i livelli di sIgA specifiche in VLF, BALF, NLF e SILF mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
2. Per il rivestimento dell'antigene, diluire l'OVA a 5 μg/mL con il tampone di rivestimento e rivestire le piastre ELISA a 96 pozzetti per una notte a 4 °C con 100 μL di soluzione OVA per pozzetto.
3. Lavare le piastre ELISA 5 volte con PBST e bloccare mediante incubazione con 250 μl di 1%BSA/PBST a 37 °C per 2 ore.
4. Lavare le piastre ELISA 5 volte con PBST, quindi aggiungere 100 μl del campione diluito come descritto di seguito da testare e incubare a 37 °C per 1 ora. Siero diluito, VLF, BALF, NLF con 0,5% BSA/PBST, SILF diluito con siero fetale di vitello al 20% (FCS)/PBST.
   1. Iniziare diluendo il siero 1000 volte utilizzando una procedura di diluizione in due fasi: diluire 20 μL di siero a 1 mL, quindi diluire 25 μL di questo siero diluito a 500 μL. Utilizzare questa diluizione del siero per la rilevazione di IgG1, IgG2a.
5. Aggiungere 200 μl di siero diluito a 1000x alla prima fila della piastra rivestita e aggiungere 100 μl di BSA/PBST allo 0,5% a tutti i pozzetti tranne la prima fila. Trasferire 100 μl dalla prima alla seconda fila e mescolare 10 volte con la pipetta. Ripetere questo passaggio fino alla riga 8 e scartare 100 μL di liquido, il siero di diverse concentrazioni è stato ottenuto per la rilevazione delle IgG.
6. Eseguire una diluizione 1:1 di BALF, NLF e SILF per rilevare le IgA. Utilizzare la stessa procedura di diluizione per VLF come quella per il siero.
7. Lavare le piastre ELISA 5 volte con PBST. Aggiungere 100 μL di IgG/IgG1/IgG2a/IgA di capra anti-topo coniugate con HRP (diluite 1:10000 con PBST) nei pozzetti appropriati e incubare a 37 °C per 40 minuti.
8. Lavare le piastre ELISA 5 volte con PBST, aggiungere 100 μl di substrato ELISA TMB (altamente sensibile) e trasferire la piastra in un luogo protetto dalla luce per 5 minuti. Aggiungere immediatamente 100 μl di soluzione di arresto a 450 nm per il substrato TMB per arrestare la reazione.
9. Misurare l'assorbanza (OD) a 450 nm per ciascun pozzetto e calcolare il titolo anticorpale prendendo 2,1 volte il valore sierico del topo del gruppo bianco come valore di risposta positiva.

5. Saggio ELISpot

1. Seguire le linee guida per ELISpot Plus, utilizzare Mouse IFN-γ (ALP) del kit per eseguire i saggi.
2. Rimuovere la piastra dalla confezione sigillata e lavare 4 volte con PBS sterile (200 μL/pozzetto). Condizionare la piastra con 1640 terreno completo (200 μL/pozzetto) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Rimuovere il terreno e aggiungere alla piastra la concentrazione aggiustata di sospensione linfocitaria preparata al punto 3.2.2 (100 μL/pozzetto), quindi aggiungere 100 μL dello stimolo, ovvero 1640 terreno completo contenente 20 μg/mL di terreno completo OVA257~264 o OVA323~339 o 1640. Porre la piastra in un'incubatrice umidificata a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48 ore. Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio per evitare l'evaporazione.
4. Eliminare la sospensione cellulare e lavare la piastra 5 volte con PBS (200 μL/pozzetto). Diluire l'anticorpo di rilevazione (R4-6A2-biotina) a 1 μg/mL in PBS contenente lo 0,5% di siero fetale di vitello (PBS-0,5% FCS). Aggiungere 100 μL/pozzetto e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
5. Lavare la piastra come al punto 5.2. Diluire la streptavidina-ALP (1:1000) in PBS-0,5%FCS e aggiungere 100 μL/pozzetto, incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Lavare la piastra come al punto 5.2. Filtrare la soluzione di substrato pronta all'uso (BCIP/NBT-plus) attraverso un filtro da 0,45 μm e aggiungere 100 μL/pozzetto. Sviluppa fino a quando non emergono macchie distinte.
7. Arrestare lo sviluppo del colore lavando abbondantemente in acqua di rubinetto, rimuovere la plastica morbida e lasciare asciugare la piastra.
8. Ispeziona e conta i punti in un lettore ELISpot.

6. Analisi statistica

1. Analizzare le differenze tra i dati di 4 gruppi mediante ANOVA unidirezionale seguita da confronto multiplo Tukey post-test. Esprimere tutti i risultati come media ± SD. Il valore P inferiore a 0,05 è stato considerato significativo.

Risultati

In totale, sono state preparate quattro formulazioni di nanoemulsioni caratterizzate dalla dimensione delle particelle (Figura 1), dal potenziale zeta e dall'efficienza di incapsulamento, come presentato nella Tabella 2. La dimensione delle particelle era concentrata intorno a 160-190 nm e l'aggiunta di DOTAP ha invertito il potenziale Zeta della nanoemulsione. Le IgG sieriche specifiche per gli OVA e il livello di anticorpi del suo sottogruppo nel siero sono stati rilevati ...

Discussione

In questo protocollo, abbiamo sviluppato un acido retinoico incapsulato in nanoemulsione cationica da utilizzare come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose antigene-specifiche. Rispetto ai tradizionali adiuvanti NE, presenta i seguenti due vantaggi. In primo luogo, in generale, la superficie degli O/W EN ha un'elevata carica negativa, che rende difficile caricare direttamente gli antigeni. Le EN cationiche possono adsorbire efficacemente antigeni peptidici o proteici e migliorare l'immunogenicità specifi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1640 medium	GIBCO, USA	C11875500BT
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab171529-1000 mL
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BSA	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
Danamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer Nano S90
DOTAP	CordenPharma, Switzerland	O02002
ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)	mabtech	ab205719
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)	Abcam	ab97240-1mg
Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)	Abcam	ab97235-1mg
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)	Abcam	Ab205720-500ug
Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)	Abcam	ab97245-1mg
High pressure homogenizer	ATS
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
OVA323-339	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Phosphate buffer saline	ZSGB-bio	ZLI-9061
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
retinoic acid	TCI, Japan	TCI-R0064-5G
Squalene	Sigma, USA	S3626
T10 basic Ultra-Turrax	IKA, Germany
TMB ELISA Substrate	Abcam	ab171523-1000ml
trypsin inhibitor	Diamond	A003570-0100
Tween-20	Macklin, China	9005-64-5
Ultraviolet spectrophotometer	Hitachi	U-3900