Acide rétinoïque encapsulé dans une nanoémulsion cationique en tant qu’adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’OVA

Résumé

Dans ce protocole, nous avons développé un acide rétinoïque (AR) encapsulé dans une nanoémulsion cationique à utiliser comme adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’antigène. En ajoutant l’AR approuvé par la FDA à la nanoémulsion, la sIgA spécifique de l’antigène a été promue dans le vagin et l’intestin grêle après l’injection intramusculaire de la nanoémulsion.

Résumé

Les nanostructures cationiques sont apparues comme un adjuvant et un système d’administration d’antigène qui améliore la maturation des cellules dendritiques, la génération de ROS et l’absorption de l’antigène, puis favorise les réponses immunitaires spécifiques à l’antigène. Ces dernières années, l’acide rétinoïque (AR) a fait l’objet d’une attention croissante en raison de son effet sur l’activation de la réponse immunitaire des muqueuses ; cependant, afin d’utiliser la PR comme adjuvant de la muqueuse, il est nécessaire de résoudre le problème de sa dissolution, de sa charge et de son administration. Ici, nous décrivons un système d’administration d’acide rétinoïque encapsulé dans une nanoémulsion cationique (CNE-RA) composé du lipide cationique 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOTAP), de l’acide rétinoïque, du squalène en tant que phase huileuse, du polysorbate 80 en tant que tensioactif et du trioléate de sorbitan 85 en tant que co-surfactant. Ses propriétés physiques et chimiques ont été caractérisées à l’aide d’une diffusion dynamique de la lumière et d’un spectrophotomètre. L’immunisation des souris avec le mélange d’antigène (ovalbumine, OVA) et d’ANC-RA a significativement augmenté les taux d’immunoglobuline sécrétoire A (sIgA) anti-OVA dans le liquide de lavage vaginal et le liquide de lavage de l’intestin grêle des souris par rapport à l’OVA seul. Ce protocole décrit une méthode détaillée pour la préparation, la caractérisation et l’évaluation de l’effet adjuvant de l’AR-CNE.

Introduction

Les adjuvants sont souvent utilisés pour améliorer l’efficacité d’un vaccin en stimulant le système immunitaire à réagir plus fortement au vaccin, augmentant ainsi l’immunité contre un agent pathogène particulier¹. L’adjuvant de nanoémulsion (NE) fait référence à un système de dispersion colloïdale avec une stabilité thermodynamique en émulsionnant une certaine proportion de phase huileuse et de phase aqueuse pour produire une émulsion sous forme d’eau dans l’huile (P/O) ou d’huile dans l’eau (H/O)². L’adjuvant de nanoémulsion H/E peut produire des cytokines et des chimiokines au site d’injection, induire l’agrégation et la prolifération rapides de cellules immunitaires importantes telles que les monocytes, les neutrophiles et les éosinophiles, et renforcer la réponse immunitaire et améliorer l’immunogénicité des antigènes³. À l’heure actuelle, trois adjuvants de nanoémulsion (MF59, AS03 et AF03) ont été homologués pour une utilisation dans les vaccins et ont montré une bonne innocuité et efficacité⁴.

Cependant, l’immunité des muqueuses a été mal prise en compte par les formulations adjuvantes actuellement autorisées dans la vaccination parentérale conventionnelle⁵. Il a été rapporté que l’acide rétinoïque (AR) induit le retour intestinal des cellules immunitaires, mais sa faible polarité, sa faible solubilité dans l’eau et sa faible stabilité à la lumière et à la chaleur limitent son utilisation pour la vaccination entérique robuste. Les nanoémulsions offrent des possibilités d’augmenter la biodisponibilité des médicaments hautement lipophiles, et le noyau huileux des adjuvants d’émulsion H/E convient à la dissolution de substances non polaires telles que le RA⁶. Par conséquent, les nanoémulsions peuvent être utilisées comme vecteurs de la PR afin d’obtenir l’effet de double réponse de l’immunité systémique et de l’immunité muqueuse.

Comparés aux systèmes d’administration neutres ou anioniques, les systèmes d’administration cationique ont des capacités d’encapsulation et d’administration d’antigènes relativement efficaces, ce qui peut améliorer l’immunogénicité des antigènes ^7,8,9. La charge cationique de surface d’une variété de systèmes adjuvants est importante pour leurs effets adjuvants 10,11,12. La charge cationique est un facteur important dans la prolongation de la rétention du vaccin au site d’injection, l’augmentation de la présentation de l’antigène et la stimulation de l’immunité cellulaire dans le corps¹².

Sur la base des considérations ci-dessus, nous avons développé une nanoémulsion cationique pour co-administrer efficacement la PR et les antigènes. La taille des particules et le potentiel zêta de la nanoémulsion ont été déterminés à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS), et les réponses immunitaires systémiques et muqueuses de la nanoémulsion combinée à l’OVA ont été évaluées par injection intramusculaire¹³.

Protocole

Les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Guide d’utilisation et de soins des animaux de laboratoire et approuvées par le Comité d’éthique et de bien-être des animaux de laboratoire de la Troisième Université de médecine militaire.

1. Préparation de nanoémulsions (EN)

1. Pour la préparation en phase aqueuse, dissoudre 0,15 g de polysorbate 80 dans 28,2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en agitant à 40 °C.
2. Pour la préparation en phase huileuse, utilisez la formulation en phase huileuse de la nanoémulsion illustrée dans le tableau 1. Dissoudre le trileate de sornitan 85, DOTAP et RA dans le squalène en remuant à 40 °C.
3. Pour la préparation primaire d’émulsion H/E, agiter magnétiquement la phase huileuse à 1400 tr/min tout en ajoutant l’aqueux lentement et goutte à goutte à un débit de 1 mL/min. Pré-émulsionner le mélange à l’aide d’un émulsifiant à haut cisaillement à 30 000 tr/min pendant 6 min.
4. Pour l’homogénéisation à haute pression (HPH), traiter l’émulsion H/E primaire préparée ci-dessus avec un homogénéisateur à haute pression pendant 12 cycles à 900 bar afin d’obtenir une nano-émulsion homogène dans la gamme 160-190 nm.
5. À la fin du processus, recueillir l’émulsion dans une fiole de 50 mL et la stériliser par filtration à travers une membrane filtrante en PES de 0,2 μm.
6. Connectez le ballon à la ligne Schlenk par le cathéter, en tournant le robinet d’arrêt à trois voies pour connecter le système au tube à vide et en allumant la pompe à vide pour créer le vide dans le ballon. Ensuite, en tournant le robinet d’arrêt à trois voies, connectez le système au tube d’argon et remplissez-le d’argon. Répétez cette étape 3 fois pour vous assurer que la fiole est remplie d’argon.
7. Remplacez le bouchon et le sceau par un film de paraffine, enveloppez le ballon dans du papier d’aluminium et conservez-le à 4 °C.

2. Caractérisation des nanoémulsions

1. Détection de la taille des particules et du potentiel zêta
   1. Allumez l’instrument et attendez 30 min que la source lumineuse laser se stabilise.
   2. Diluez le NE 50 fois avec de l’eau ultrapure et ajoutez 1 mL d’échantillon dans la cellule d’échantillonnage correspondante.
   3. Pour mesurer la taille des particules, réglez la température sur 25 °C, sélectionnez l’eau comme fluide dispersant et choisissez la vaisselle en plastique jetable comme cellule de mesure. Chargez les échantillons et mesurez automatiquement. Indiquez la valeur moyenne de trois mesures répétées pour chaque échantillon comme résultat final.
   4. Pour la mesure du potentiel zêta, réglez la température sur 25 °C. En raison du choix de la phase aqueuse comme milieu de dispersion, sélectionnez le modèle Smoluchowsi et la cellule capillaire pliée comme cellule de mesure. Chargez les échantillons et mesurez automatiquement. Indiquez la moyenne de trois mesures répétées pour chaque échantillon comme résultat final.
2. Détermination du taux d’encapsulation et du taux de charge du médicament
   1. Pour déterminer la quantité d’AR chargée dans l’EN, utilisez de l’éthanol absolu pour désémulsionner et extraire l’AR de l’EN. À 5 μL d’échantillon, ajouter 995 μL d’éthanol et déterminer la teneur en RA de la solution à l’aide d’un spectrophotomètre à 355 nm. Comparez l’absorbance à une courbe standard. Utilisez l’équation suivante :
      Encapsulation = charge AR/poids réel du médicament ajouté
      Taux de charge du médicament = charge réelle de l’AR / qualité de l’échantillon

3. Procédures d’immunisation et prélèvement d’échantillons

1. Procédure d’immunisation et regroupement
   1. Regrouper les souris femelles Balb/C âgées de 6 à 8 semaines et pesant environ 18 à 21 g par groupes de 5 pour l’immunisation le jour 0, le jour 14 et le jour 28 selon les groupes expérimentaux suivants : (1) groupe PBS, (2) groupe ovalbumine (OVA), (3) groupe OVA+ NE-RA (OVA/NE-RA), (4) groupe OVA+CNE-RA (OVA/CNE-RA).
   2. Immuniser toutes les souris par injection intramusculaire dans les muscles quadriceps supérieurs avec 200 μL de différentes formulations vaccinales : 100 μL d’émulsion et 15 μg d’OVA absorbés dans 100 μL de PBS, mélangés avant l’administration. Injecter 100 μL/patte arrière. Pour les souris du groupe témoin, administrez PBS seul.
   3. Euthanasie : Euthanasier toutes les souris par une injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à 1 % 2 semaines après la fin des trois vaccinations.
   4. Prélèvement et traitement de l’échantillon : Après l’euthanasie, utiliser des ciseaux pour ouvrir la poitrine des souris et insérer une seringue directement dans le cœur pour aspirer environ 0,5 mL de sang total. Laisser reposer le sang pendant 2 h à température ambiante, puis centrifuger à 1800 x g pendant 5 min à 4 °C. Prélever le sérum, l’aliquote et conserver à -80 °C pour une analyse plus approfondie.
   5. Prélever du sang total, de la rate, du liquide de lavage vaginal (VLF), du liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF), du liquide de lavage nasal (NLF) et du liquide de lavage de l’intestin grêle (SILF).
2. Isolement des lymphocytes spléniques
   1. Faites tremper les souris dans de l’éthanol à 75% (v/v) pour une brève stérilisation, transférez les souris sur un banc propre. Coupez la peau de l’abdomen gauche avec des ciseaux, exposez et retirez la rate.
   2. Placez la rate dans une boîte de Pétri contenant 3 ml de PBS, broyez et filtrez dans un tube à centrifuger de 15 ml à l’aide d’un tamis (200 mesh, 70 μm) et d’une tige de broyage.
   3. Centrifugez les cellules à 650 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et suspendre le précipité avec 3 mL de solution de lyse des globules rouges, incuber à température ambiante pendant 5 min.
   4. Ajouter 10 mL de PBS dans le tube et bien agiter pour terminer la réaction, puis le centrifuger à 650 x g pendant 5 min à température ambiante.
   5. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 10 mL de PBS, ajouter 20 μL de dilution cellulaire au compteur de cellules automatisé pour le comptage des cellules.
   6. Centrifugez les cellules à 650 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et diluer les cellules à 1 x 10⁶ cellules/mL avec un milieu complet 1640 (1 % de pénicilline-streptomycine, 10 % de sérum fœtal de bovin).
3. Prélèvement VLF : Rincer le vagin 4 fois avec 75 μL de BSA/PBST à 1 %, combiner la solution de lavage et prélever dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL, centrifuger à 5000 x g à 4 °C pendant 20 min et prélever le surnageant à l’aide d’une pipette et le conserver à -80 °C.
4. Collection BALF et NLF
   1. Désinfectez les souris après le sacrifice avec de l’éthanol à 75 % (v/v). Tenez le ventre de la souris vers le haut et redressez le cou. Utilisez des ciseaux pour faire une incision longitudinale dans la peau du cou de la souris et utilisez des pinces pour séparer les muscles et exposer la trachée de manière adéquate.
   2. Couper la trachée par une petite ouverture transversale et insérer le tuyau vers les poumons, fixer la seringue au tuyau et injecter 0,5 mL de PBS dans les poumons et retirer, répéter le rinçage 3 fois et centrifuger à 650 x g à 4 °C pendant 5 min, stocker le surnageant (BALF) à -80 °C.
   3. Inversez le tuyau vers la cavité nasale, fixez la seringue au tuyau et injectez 0,5 ml de PBS, le liquide s’écoulera à travers la cavité nasale dans le tube à centrifuger de 1,5 ml. Aspirez le lavage du tube à centrifuger et répétez le rinçage 2 fois, puis centrifugez à 650 x g à 4 °C pendant 5 min, stockez le surnageant (NLF) à -80 °C.
5. Collection SILF
   1. Préparez une solution de PBS contenant 0,1 mg/mL d’inhibiteur de trypsine, 50 mM/L D’EDTA-2Na, 1 mM/L de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) comme solution de lavage de l’intestin grêle. Remuer à température ambiante pour dissoudre et conserver à 4 °C.
   2. Ouvrez l’intestin grêle le long de la trompe intestinale et plongez-le dans 3 ml de liquide de lavage de l’intestin grêle. Mélanger par agitation verticale à 15 tr/min pendant 30 min à 4 °C. Centrifuger à 1440 x g à 4 °C pendant 20 min et prélever le surnageant à l’aide d’une pipette, puis centrifuger à 5000 x g à 4 °C pendant 20 min. Stockez le surnageant (SILF) à -80 °C.

4. Évaluation de la réponse anticorps spécifiques de l’OVA après administration intramusculaire

1. Déterminer les taux sériques d’IgG, les sous-classes d’IgG1 et d’IgG2a et les taux d’IgA spécifiques dans les VLF, BALF, NLF et SILF à l’aide d’un test immuno-enzymatique (ELISA).
2. Pour l’enrobage d’antigène, diluer l’OVA à 5 μg/mL avec un tampon d’enrobage, et enduire les plaques ELISA à 96 puits pendant la nuit à 4 °C avec 100 μL de solution d’OVA par puits.
3. Laver les plaques ELISA 5 fois avec du PBST et les bloquer par incubation avec 250 μL de BSA/PBST à 1 % à 37 °C pendant 2 h.
4. Laver les plaques ELISA 5 fois avec du PBST, puis ajouter 100 μL de l’échantillon dilué comme décrit ci-dessous à tester et incuber à 37 °C pendant 1 h. Sérum dilué, VLF, BALF, NLF avec 0,5 % BSA/PBST, SILF dilué avec 20 % de sérum de veau fœtal (FCS)/PBST.
   1. Commencez par diluer le sérum 1000x en utilisant une procédure de dilution en deux étapes : diluez 20 μL de sérum à 1 mL, puis diluez 25 μL de ce sérum dilué à 500 μL. Utilisez cette dilution de sérum pour la détection des IgG1, IgG2a.
5. Ajouter 200 μL de sérum dilué à 1000x sur la première rangée de la plaque revêtue et ajouter 100 μL de BSA/PBST à 0,5 % dans tous les puits sauf la première rangée. Transférez 100 μL de la première rangée à la deuxième rangée et mélangez 10 fois avec la pipette. Répétez cette étape jusqu’à la rangée 8 et jetez 100 μL de liquide, le sérum de différentes concentrations a été obtenu pour la détection des IgG.
6. Effectuez une dilution 1:1 de BALF, NLF et SILF pour détecter les IgA. Utilisez la même procédure de dilution pour le VLF que pour le sérum.
7. Laver les plaques ELISA 5 fois avec PBST. Ajouter 100 μL d’IgG/IgG1/IgG2a/IgA de chèvre conjuguée HRP (diluée 1:10000 avec PBST) dans les puits appropriés et incuber à 37 °C pendant 40 min.
8. Lavez les plaques ELISA 5 fois avec du PBST, ajoutez 100 μL de substrat ELISA TMB (très sensible) et transférez la plaque dans un endroit à l’abri de la lumière pendant 5 min. Ajouter immédiatement 100 μL de solution d’arrêt à 450 nm pour substrat TMB afin d’arrêter la réaction.
9. Mesurez l’absorbance (OD) à 450 nm pour chaque puits et calculez le titre d’anticorps en prenant 2,1 fois la valeur sérique de la souris du groupe blanc comme valeur de réponse positive.

5. Test ELISpot

1. Suivez les directives pour ELISpot Plus, utilisez l’IFN-γ de souris (ALP) du kit pour effectuer les tests.
2. Retirez la plaque de l’emballage scellé et lavez-la 4 fois avec du PBS stérile (200 μL/puits). Conditionner la plaque avec du milieu complet 1640 (200 μL/puits) et incuber pendant 30 min à température ambiante.
3. Retirer le milieu et ajouter à la plaque la concentration ajustée de suspension lymphocytaire préparée à l’étape 3.2.2 (100 μL/puits), puis ajouter 100 μL du stimulus, c’est-à-dire 1640 milieux complets contenant 20 μg/mL OVA257~264 ou OVA323~339 ou 1640 milieux complets. Placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 48 h. Enveloppez la plaque avec du papier d’aluminium pour éviter l’évaporation.
4. Jeter la suspension cellulaire et laver la plaque 5 fois avec du PBS (200 μL/puits). Diluer l’anticorps de détection (R4-6A2-biotine) à 1 μg/mL dans du PBS contenant 0,5 % de sérum de veau fœtal (PBS-0,5 % de FCS). Ajouter 100 μL/puits et incuber pendant 2 h à température ambiante.
5. Laver la plaque comme à l’étape 5.2. Diluer la streptavidine-ALP (1:1000) dans du PBS-0,5 % FCS et ajouter 100 μL/puits, incuber pendant 1 h à température ambiante.
6. Laver la plaque comme à l’étape 5.2. Filtrer la solution de substrat prête à l’emploi (BCIP/NBT-plus) à travers un filtre de 0,45 μm et ajouter 100 μL/puits. Se développer jusqu’à ce que des taches distinctes apparaissent.
7. Arrêtez le développement de la couleur en lavant abondamment à l’eau du robinet, retirez le plastique souple et laissez sécher la plaque.
8. Inspectez et comptez les points dans un lecteur ELISpot.

6. Analyse statistique

1. Analysez les différences entre les données de 4 groupes par ANOVA à un facteur suivie d’un post-test de comparaison multiple de Tukey. Exprimer tous les résultats en moyenne ± écart-type. Une valeur P inférieure à 0,05 a été considérée comme significative.

Résultats

Au total, quatre formulations de nanoémulsion ont été préparées et caractérisées par leur taille de particule (Figure 1), leur potentiel zêta et leur efficacité d’encapsulation comme présenté dans le Tableau 2. La taille des particules a été concentrée autour de 160-190 nm et l’ajout de DOTAP a inversé le potentiel zêta de la nanoémulsion. Les IgG sériques spécifiques de l’OVA et son taux d’anticorps du sous-groupe dans le sérum ont été détect?...

Discussion

Dans ce protocole, nous avons développé un acide rétinoïque encapsulé dans une nanoémulsion cationique à utiliser comme adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’antigène. Par rapport aux adjuvants NE traditionnels, il présente les deux avantages suivants. Tout d’abord, en général, la surface des EN H/E a une charge négative élevée, ce qui rend difficile la charge directe des antigènes. Les ENs cationiques peuvent adsorber efficacement les antigènes peptidiques ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1640 medium	GIBCO, USA	C11875500BT
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab171529-1000 mL
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BSA	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
Danamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer Nano S90
DOTAP	CordenPharma, Switzerland	O02002
ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)	mabtech	ab205719
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)	Abcam	ab97240-1mg
Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)	Abcam	ab97235-1mg
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)	Abcam	Ab205720-500ug
Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)	Abcam	ab97245-1mg
High pressure homogenizer	ATS
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
OVA323-339	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Phosphate buffer saline	ZSGB-bio	ZLI-9061
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
retinoic acid	TCI, Japan	TCI-R0064-5G
Squalene	Sigma, USA	S3626
T10 basic Ultra-Turrax	IKA, Germany
TMB ELISA Substrate	Abcam	ab171523-1000ml
trypsin inhibitor	Diamond	A003570-0100
Tween-20	Macklin, China	9005-64-5
Ultraviolet spectrophotometer	Hitachi	U-3900