OVA 특이적 전신 및 점막 반응을 촉진하기 위한 보조제로서의 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산

요약

이 프로토콜에서는 항원 특이적 전신 및 점막 반응을 촉진하기 위한 보조제로 사용할 수 있는 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산(RA)을 개발했습니다. FDA 승인 RA를 나노에멀젼에 첨가함으로써, 나노에멀젼의 근육 주사 후 질과 소장에서 항원 특이적 sIgA를 촉진시켰다.

초록

양이온성 나노구조체는 수지상세포 성숙, ROS 생성 및 항원 흡수를 향상시키고 항원 특이적 면역 반응을 촉진하는 보조제 및 항원 전달 시스템으로 부상했습니다. 최근 몇 년 동안 레티노산(RA)은 점막 면역 반응을 활성화하는 효과로 인해 점점 더 주목을 받고 있습니다. 그러나, RA를 점막 보조제로 사용하기 위해서는 이의 용해, 로딩 및 전달의 문제를 해결할 필요가 있다. 여기에서는 양이온성 지질 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOTAP), 레티노산, 스쿠알렌을 기름상으로, 폴리소르베이트 80을 계면활성제로, 소르비탄 트리올에이트 85를 보조계면활성제로 구성하는 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산(CNE-RA) 전달 시스템에 대해 설명합니다. 그것의 물리적, 화학적 특성은 동적 광 산란과 분광 광도계를 사용하여 특성화되었습니다. 항원(오브알부민, OVA)과 CNE-RA의 혼합물을 마우스에 접종한 결과, OVA 단독에 비해 질 세척액과 마우스의 소장 세척액에서 항-OVA 분비 면역글로불린 A(sIgA) 수치가 유의하게 상승했습니다. 이 프로토콜은 CNE-RA의 보조제 효과의 준비, 특성화 및 평가를 위한 자세한 방법을 설명합니다.

서문

보조제는 면역 체계가 백신에 더 강하게 반응하도록 자극하여 특정 병원체에 대한 면역력을 증가시킴으로써 백신의 효능을 향상시키는 데 자주 사용됩니다¹. 나노에멀젼(NE) 보조제는 유상과 수성을 일정 비율의 유화하여 W/O(water-in-oil) 또는 O/W(oil-in-water) 형태의 에멀젼을 생성함으로써 열역학적 안정성을 가진 콜로이드 분산 시스템을 말합니다.². O/W 나노에멀젼 보조제는 주사 부위에서 사이토카인과 케모카인을 생성하고, 단핵구, 호중구, 호산구와 같은 중요한 면역 세포의 빠른 응집 및 증식을 유도하고, 면역 반응을 향상시키고, 항원의 면역원성을 향상시킬 수 있습니다³. 현재 3종의 나노에멀젼 보조제(MF59, AS03, AF03)가 백신에 사용 허가를 받았으며 우수한 안전성과 효능을 보이고 있다⁴.

그러나, 점막 면역은 기존의 비경구 백신 접종에서 현재 허가된 보조제 제형으로는 잘 다루어지지 않았다⁵. 레티노산(RA)은 면역 세포의 장 귀환을 유도하는 것으로 보고되었지만, 극성이 낮고 물에 대한 용해도가 낮으....

프로토콜

동물실험은 실험동물의 사용 및 관리 가이드에 따라 수행되었으며 제3군 의과대학 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 나노 에멀젼(NE)의 제조

1. 수성 상 준비를 위해 40°C에서 교반하면서 0.15g의 폴리소르베이트 80을 28.2mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시킵니다.
2. 유상 제조를 위해, 표 1에 나타낸 나노에멀젼의 유상 제형을 사용한다. 40°C에서 교반하면서 sornitan trileate 85, DOTAP 및 RA를 스쿠알렌에 용해시킵니다.
3. 1차 O/W 에멀젼 준비의 경우 1400rpm에서 오일 상을 자기적으로 저어주면서 수성을 1mL/분의 속도로 천천히 적가합니다. 30,000rpm에서 고전단 유화제를 사용하여 6분 동안 혼합물을 사전 유화합니다.
4. 고압 균질화(HPH)의 경우 위에서 준비한 1차 O/W 에멀젼을 900bar에서 12사이클 동안 고압 균질화기로 처리하여 160-190nm 범위의 균질한 나노 에멀젼을 얻습니다.
5. 공정이 끝나면 50mL 플라스크에 에멀젼을 모으고 0.2μm PES 필터 멤브레인을 통해 에멀젼을 필터 멸균합니다.
6. 카테터를 통....

토론

이 프로토콜에서는 항원 특이적 전신 및 점막 반응을 촉진하기 위한 보조제로 사용할 수 있는 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산을 개발했습니다. 기존 NE 보조제와 비교하여 다음과 같은 두 가지 장점이 있습니다. 첫째, 일반적으로 O/W NEs의 표면은 음전하가 높아 항원을 직접 로드하기 어렵다. 양이온성 NE는 펩타이드 또는 단백질 항원을 효과적으로 흡착하고 특정 면역원성을 향상시킬 수 있?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1640 medium	GIBCO, USA	C11875500BT
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab171529-1000 mL
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BSA	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
Danamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer Nano S90
DOTAP	CordenPharma, Switzerland	O02002
ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)	mabtech	ab205719
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)	Abcam	ab97240-1mg
Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)	Abcam	ab97235-1mg
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)	Abcam	Ab205720-500ug
Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)	Abcam	ab97245-1mg
High pressure homogenizer	ATS
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
OVA323-339	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Phosphate buffer saline	ZSGB-bio	ZLI-9061
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
retinoic acid	TCI, Japan	TCI-R0064-5G
Squalene	Sigma, USA	S3626
T10 basic Ultra-Turrax	IKA, Germany
TMB ELISA Substrate	Abcam	ab171523-1000ml
trypsin inhibitor	Diamond	A003570-0100
Tween-20	Macklin, China	9005-64-5
Ultraviolet spectrophotometer	Hitachi	U-3900