Ретиноевая кислота, инкапсулированная катионной наноэмульсией, в качестве адъюванта для стимулирования OVA-специфических системных и слизистых реакций

Резюме

В этом протоколе мы разработали ретиноевую кислоту (РА), инкапсулированную катионной наноэмульсией, для использования в качестве адъюванта для стимулирования антиген-специфических системных и слизистых реакций. При добавлении одобренного FDA RA в наноэмульсию антиген-специфический sIgA стимулировался во влагалище и тонком кишечнике после внутримышечного введения наноэмульсии.

Аннотация

Катионные наноструктуры появились как адъювант и система доставки антигенов, которая усиливает созревание дендритных клеток, генерацию АФК и поглощение антигена, а затем способствует антиген-специфическим иммунным реакциям. В последние годы все большее внимание уделяется ретиноевой кислоте (РА) из-за ее эффекта в активации иммунного ответа слизистой оболочки; однако для того, чтобы использовать РА в качестве вспомогательного средства слизистой, необходимо решить проблему его растворения, загрузки и доставки. Здесь мы описываем систему доставки катионной наноэмульсии, инкапсулированную ретиноевой кислотой (CNE-RA), состоящую из катионного липида 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (ДОТАП), ретиноевой кислоты, сквалена в качестве масляной фазы, полисорбата 80 в качестве поверхностно-активного вещества и сорбитана триолеата 85 в качестве сопутствующего поверхностно-активного вещества. Его физико-химические свойства были охарактеризованы с помощью динамического рассеяния света и спектрофотометра. Иммунизация мышей смесью антигена (овальбумина, OVA) и CNE-RA значительно повысила уровни анти-OVA секреторного иммуноглобулина А (sIgA) в жидкости для промывания влагалища и жидкости для промывания тонкой кишки мышей по сравнению с одной OVA. В этом протоколе подробно описан метод получения, характеристики и оценки адъювантного эффекта CNE-RA.

Введение

Адъюванты часто используются для повышения эффективности вакцины, стимулируя иммунную систему более сильно реагировать на вакцину, тем самым повышая иммунитет к определенному патогену¹. Адъювант наноэмульсии (NE) относится к коллоидной дисперсионной системе с термодинамической стабильностью путем эмульгирования определенной доли масляной фазы и водной фазы с получением эмульсии в форме воды в масле (W/O) или масла в воде (O/W)². Н/В наноэмульсионный адъювант может продуцировать цитокины и хемокины в месте инъекции, индуцировать быструю агрегацию и пролиферацию важных иммунных клеток, таких как моноциты, нейтрофилы и эози....

протокол

Эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по использованию и уходу за лабораторными животными и одобрены Комитетом по благополучию и этике лабораторных животных Третьего военно-медицинского университета.

1. Приготовление наноэмульсий (НЭ)

1. Для получения водной фазы растворяют 0,15 г полисорбата 80 в 28,2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) при перемешивании при 40 °C.
2. Для приготовления масляной фазы используют масляную фазу наноэмульсии, показанную в таблице 1. Растворите трилеат сорнитана 85, DOTAP и RA в сквалене при перемешивании при 40 °C.
3. Для приготов....

Результаты

В общей сложности было приготовлено четыре наноэмульсионных состава, которые характеризовались размером частиц (рис. 1), дзета-потенциалом и эффективностью инкапсуляции, как показано в таблице 2. Размер частиц был сосредоточен около 160-190 нм, и добавление DOTAP обр?.......

Обсуждение

В этом протоколе мы разработали катионную ретиноевую кислоту, инкапсулированную наноэмульсией, для использования в качестве адъюванта для стимулирования антиген-специфических системных и слизистых реакций. По сравнению с традиционными адъювантами NE он имеет следующие два преимущес.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1640 medium	GIBCO, USA	C11875500BT
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab171529-1000 mL
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BSA	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
Danamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer Nano S90
DOTAP	CordenPharma, Switzerland	O02002
ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)	mabtech	ab205719
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)	Abcam	ab97240-1mg
Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)	Abcam	ab97235-1mg
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)	Abcam	Ab205720-500ug
Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)	Abcam	ab97245-1mg
High pressure homogenizer	ATS
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
OVA323-339	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Phosphate buffer saline	ZSGB-bio	ZLI-9061
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
retinoic acid	TCI, Japan	TCI-R0064-5G
Squalene	Sigma, USA	S3626
T10 basic Ultra-Turrax	IKA, Germany
TMB ELISA Substrate	Abcam	ab171523-1000ml
trypsin inhibitor	Diamond	A003570-0100
Tween-20	Macklin, China	9005-64-5
Ultraviolet spectrophotometer	Hitachi	U-3900