Nehmen Sie zunächst die vorbereiteten submitochondrialen Hefevesikel und zentrifugieren Sie die erzeugten Vesikel und die verbleibenden intakten Mitochondrien bei 20.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Die intakten Mitochondrien bildeten das Pellet, während die Vesikel im Überstand verbleiben. Als nächstes wird der Überstand in frische Ultrazentrifugationsröhrchen überführt.
Ein Polster von 0,3 Millilitern 2,5 molar Saccharoselösung mit einer Ein-Milliliter-Spritze mit Kanüle in den Boden des Röhrchens geben und bei 118.000 G 100 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation erscheinen die Vesikel als Scheibe auf der Oberseite des Saccharosekissens. Verwerfen Sie ca. 90 % des Überstandes.
Um die konzentrierten Vesikel zu ernten, resuspendieren Sie sie im verbleibenden Puffer, einschließlich der 2,5-molaren Saccharose, durch Pipettieren. Die Suspension in einen eiskalten Dounce-Homogenisator überführen und die Suspension mit einem Polytetrafluorethylen-Töpfer mit mindestens 10 Hüben homogenisieren. Als nächstes bereiten Sie einen 11-Milliliter-Stufengradienten vor, wobei jede Schicht 2,2 Milliliter Saccharoselösung enthält.
Berechnen Sie die Saccharosekonzentration mit dieser Formel. Geben Sie die höchste Saccharosekonzentration in das Zentrifugationsröhrchen und stellen Sie es bei minus 20 Grad Celsius, bis die Schicht vollständig gefroren ist. Messen Sie die Saccharosekonzentration der Proben mit einem Refraktometer.
Wenn kein Refraktometer verfügbar ist, gehen Sie davon aus, dass die Saccharosekonzentration 2 molar beträgt. Um die Saccharosekonzentration auf 0,6 Molaren einzustellen, fügen Sie den entsprechenden MOPS-, E-D-T-A-, P-M-S-F- und Protease-Inhibitor-Cocktail bei pH 7,4 hinzu. Laden Sie die Proben vorsichtig auf den Saccharosegradienten, um eine Störung des Gradienten zu vermeiden.
Zentrifugieren Sie die Vesikel bei 200.000 g und vier Grad Celsius für 12 Stunden. Stellen Sie nach Möglichkeit eine langsame Beschleunigung und Verzögerung ein, um eine Unterbrechung der Steigung zu vermeiden. Ernten Sie dann den Gradienten von oben nach unten in 700-Mikroliter-Fraktionen mit einer Ein-Milliliter-Pipette.
Daraus ergeben sich 17 Fraktionen, was eine ausreichende Auflösung bietet. Als nächstes werden zwei nacheinander durchgeführte Trichloressigsäurefällungen durchgeführt, indem 200 Mikroliter 72%ige Trichloressigsäure zu den einzelnen Fraktionen gegeben und gemischt werden, bis die Lösung homogen ist. Die Fraktionen werden 30 Minuten lang auf Eis inkubiert und die gefällten Proteine durch Zentrifugieren bei 20.000 g und vier Grad Celsius für 20 Minuten pelletiert.
Verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie 500 Mikroliter 28%ige Trichloressigsäurelösung hinzu. Gut mischen und den Zentrifugationsschritt wiederholen.
Abschließend werden die Fraktionen mittels SDS-PAGE und Immunoblotting analysiert. Die Bedeutung einer milden Beschallung wird hier vorgestellt. Der mitochondriale Außenmembranmarker Tom40 war in den frühen Fraktionen niedriger Dichte angereichert und fehlte in den späteren Fraktionen praktisch nicht.
Der mitochondriale innere Membranmarker Tim17 war in Fraktionen mit hoher Dichte konzentriert. Im Gegensatz dazu akkumulierte das Kontaktstellenprotein Mic60 Brüche der intermediären Saccharosekonzentration, was auf die erfolgreiche Erzeugung und anschließende Trennung der verschiedenen Membranvesikel hinweist. Im Gegensatz dazu konnte bei härteren Beschallungsbedingungen der mitochondriale Außenmembranmarker Tom40 in niedrigeren Fraktionen des Gradienten nachgewiesen werden.
Darüber hinaus gab es eine signifikante Anzahl von Tim17-Verstößen gegen die mittlere Dichte.
