Beginnen Sie mit der Aufrechterhaltung von HEK-293T ACE2-TMPRSS2-Zellen in DMEM, die erhitztes aktiviertes FBS, Penicillin und Streptomycin enthalten, in einem T75-Kolben. Mischen Sie für die Zellzählung 20 Mikroliter Zellsuspension mit 20 Mikrolitern Trypanblaulösung. Geben Sie 20 Mikroliter farbstoffgemischte Zellsuspension in die Zellzählkammer und zählen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter.
2,5 mal 10 hoch vier HEK-293T ACE2 TMPRSS2 Zellen in 50 Mikrolitern vollständigem DMEM-Medium in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte aussäen. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag die 50 Mikroliter DMEM durch 50 Mikroliter Virussuspension ersetzen und 18 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Nach der Inkubation 7,5 Mikroliter Zelllysepuffer in jede Vertiefung geben und zwei Minuten lang auf einem Orbitalschüttler mischen. Sobald die Zellen lysiert sind, fügen Sie frisch zubereitete Glühwürmchen-Luciferase-Assay-Lösung hinzu und mischen Sie sie eine Minute lang auf einem Orbitalschüttler. Analysieren Sie die Luciferase-Aktivität mit einem handelsüblichen Luciferase-Mikroplatten-Reader.
Für den neutralisierenden Antikörper-Assay säen Sie HEK-293T-Zellen in 50 Mikrolitern vollständigem DMEM, wie zuvor gezeigt. Geben Sie in eine 96-Well-Platte acht Mikroliter 27 BV neutralisierenden Antikörper und führen Sie serielle Verdünnungen mit sechs Mikrolitern serumfreiem DMEM durch. Geben Sie 54 Mikroliter Ha-CoV-2-Viruspartikel zu dem seriell verdünnten Antikörper und mischen Sie die Suspension.
Eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid inkubieren. Geben Sie dann 50 Mikroliter Virussuspension in die Vertiefungen mit HEK-293T-Zellen. Geben Sie zur Kontrolle 50 Mikroliter vollständiges DMEM-Medium in die Vertiefungen, die nur HEK-293T-Zellen enthalten.
Stellen Sie die Platte für 18 Stunden bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Nachdem Sie die Zellen wie zuvor gezeigt lysiert haben, fügen Sie eine frisch zubereitete Glühwürmchen-Luciferase-Assay-Lösung hinzu und mischen Sie sie eine Minute lang durch orbitales Schütteln. Analysieren Sie die Luciferase-Aktivität mit einem handelsüblichen Luciferase-Mikroplatten-Reader.
Ha-CoV-2 Omicron- und Omicron-Varianten erzeugten ein vier- bis zehnfach höheres Signal als der Wildtyp Ha-CoV-2, was auf eine höhere Infektiosität hindeutet. Der Antikörper 27 BV zeigte eine neutralisierende Aktivität sowohl gegen die Delta- als auch gegen die Omikron-Variante. Der ID50 von 27 BV für Omikron war etwa 10-mal weniger wirksam als der ID50 für Wildtyp und Delta.
