Führen Sie das Protokoll in einer Biosicherheitswerkbank an der euthanasierten Maus durch, die ordnungsgemäß rasiert und mit 70 % Ethanol desinfiziert wurde. Erstellen Sie mit einer Schere einen 0,5 Zoll großen oberflächlichen Schnitt im Bauch des Tieres. Schneiden Sie in Längsrichtung entlang der Mittellinie in Richtung Hals und Unterbauch.
Machen Sie zusätzlich seitliche Schnitte, um die Haut aufzuklappen. Trennen Sie mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig die Haut vom umgebenden Gewebe, während Sie um den Oberkörper des Tieres herum die Haut seitlich um den Hals und den Unterbauch schneiden. Legen Sie die Haut vorsichtig mit der Dermisseite nach unten in eine 100-Millimeter-Gewebekulturplatte.
Und stellen Sie sicher, dass die Haut so gedehnt wie möglich ist. Geben Sie sechs Milliliter Dispase-Lösung auf die Platte und stellen Sie sicher, dass die Haut vollständig bedeckt ist. Decken Sie dann den Teller ab.
Wickeln Sie die Platte mit Parafilm ein. Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um das Explantat flach zu drücken. Entfernen Sie am nächsten Tag mit einer Pipette die Flüssigkeit von der Platte, die die isolierte Haut enthält.
Trennen Sie dann mit Hilfe einer Pinzette die Dermis von der Epidermis und entfernen Sie dabei sichtbares Fettgewebe. Und legen Sie die isolierte Dermis in eine saubere Gewebekulturplatte. Geben Sie einen Milliliter DMEM mit 1X antibiotisch-antimykotischer Lösung in die Dermis in der Kulturplatte.
Kippen Sie die Platte, um die Flüssigkeit auf einer Seite der Platte zu sammeln. Dann hacken Sie die Dermis in ein bis zwei Quadratmillimeter große Stücke. Und übertragen Sie sie in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen.
Geben Sie 10 Milliliter Kollagenase Typ II-Lösung in das Röhrchen. Inkubieren Sie es zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter ständigem Rühren bei 30 bis 50 U/min, um die Dermis zu verdauen. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb.
Und zentrifugieren Sie es bei 250 g für fünf Minuten. Nach dem Entsorgen des Überstands wird das Pellet in 10 Millimeter DMEM-haltiger antibiotisch-antimykotischer Lösung resuspendiert. Filtrieren Sie die Zellsuspension vor dem Zentrifugieren durch ein 40-Mikron-Zellsieb, wie zuvor gezeigt.
Resuspendieren Sie das resultierende Zellpellet in einem Milliliter des vollständigen LEC-Mediums. Anschließend werden die Zellen in einer kollagenbeschichteten 60-Millimeter-Gewebekulturplatte mit vollständigem LEC-Medium plattiert. Tauschen Sie das Medium alle zwei Tage aus, indem Sie die Zellen zweimal mit PBS waschen und frisches LEC-Medium hinzufügen.
Bilder mit geringer Vergrößerung von Zellen, die aus der Mausdermis isoliert wurden, zeigten eine gemischte Zellpopulation.
