Reinigung von lymphatischen Endothelzellen der Maus

Um lymphatische Endothelzellen im Urin zu reinigen, verwenden Sie Zellen, die aus der Mausdermis isoliert wurden, nachdem sie eine Co-Fluenz von etwa 80 bis 90 % erreicht haben, und beginnen Sie mit dem Waschen von vorcodierten magnetischen Kügelchen in einem Magnetseparator mit einem Milliliter magnetischer Bead-Beschichtungslösung. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 150 Mikrolitern DMEM mit einem Gehalt von 0,1 % BSA. Anschließend waschen Sie die Zellen in der 60-Millimeter-Gewebekulturplatte zweimal mit PBS.

Mischen Sie 50 Mikroliter der konjugierten Antikörperkügelchen mit drei Millilitern DMEM mit 0,1 % BSA und geben Sie es in die Zellen. Verschließen Sie die Schale mit Biofilm und inkubieren Sie die Schale dann auf einem Shaker unter Rühren bei 10 U/min bei Raumtemperatur genau 10 Minuten lang. Entsorgen Sie das Medium, bevor Sie die Zellen einmal mit PBS waschen.

Untersuchen Sie die Zellen schnell, um das Vorhandensein von LEC-Kolonien auf der Platte zu überprüfen. Geben Sie einen Milliliter Trips in EDTA in die Zellen und inkubieren Sie drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu trypsinisieren. Untersuchen Sie die Zellen auf eine erfolgreiche Zellablösung.

Nach dem Neutralisieren der Lösung mit zwei Millilitern des kompletten LEC-Mediums. Übertragen Sie die Zelllösung in ein steriles Fünf-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen. Waschen Sie die Zellen mit einem Magnetabscheider mit drei Millilitern DMEM mit 0,1 % BSA, um ungebundene Zellen zu entfernen.

Resuspendieren Sie die verbleibenden beadgebundenen Zellen in vollständigen LEC-Medien und plättieren Sie sie auf kollagenbeschichtete 60-Millimeter-Gewebekulturplatten. Hellfeld- und Fluoreszenzbildgebung identifizierten die LYVE1-positiven lymphatischen Endothelzellen nach der Aufreinigung leicht und zeigten mehrere daran befestigte Kügelchen. Die Zellen zeigten 24 Stunden nach der Aufreinigung eine geringe Konfluenz, während sie sieben Tage nach der Aufreinigung eine hohe Konfluenz aufwiesen.