Bereiten Sie zunächst die äußere GUV-Pufferlösung in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Gemischt mit Spermidin, ATP, GTP, CTP, UTP, Kreatinphosphat, Magnesiumacetat, Kaliumglutamat, HEPES, Kaliumhydroxid, Folinsäure. Glukose und Aminosäurevorräte.
Fügen Sie hochreines deionisiertes Wasser hinzu, um das endgültige Volumen der Lösung auf einen Milliliter zu bringen. Geben Sie anschließend in einem Abzug 17,3 Mikroliter POPC-Stammlösung in ein 15-Milliliter-Glasfläschchen. Dazu pipettieren Sie 1,08 Mikroliter PEO-b-PBD-Copolymer.
Blasen Sie vorsichtig einen sanften Strahl Argongas in das Glasfläschchen, während Sie das Fläschchen drehen, um das Chloroform zu verdampfen. Pipettieren Sie dann 1,2 Milliliter leichtes Mineralöl in das Glasfläschchen. Wirbeln Sie das Lipid und das Öl bei maximaler Geschwindigkeit für 10 bis 20 Sekunden ein.
Stellen Sie das Glasfläschchen für 20 Minuten bei etwa 50 Grad Celsius in einen Ofen, bevor Sie es weitere 10 bis 20 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit vortexen. Als nächstes pipettieren Sie 270 Mikroliter der äußeren GUV-Lösung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Dazu pipettieren Sie jeweils 15 Mikroliter von fünf molaren Natriumchlorid und 4,5 molaren Kaliumchlorid.
Pipettieren Sie vorsichtig 300 Mikroliter Lipid-Öl-Mischung auf die äußere GUV-Lösung. Nach der Inkubation wird eine CFE-Reaktion durch Pipettieren der Lösungen 1 bis 3, des DNA-Plasmids, das für lösliches sfGFP kodiert, oder Varianten des Glutamatrezeptors sfGFP, der murinen RNAse und einer molaren Saccharose in ein Fläschchen zusammengesetzt. Fügen Sie hochreines deionisiertes Wasser hinzu, um das Reaktionsvolumen auf 20 Mikroliter zu bringen.
600 Mikroliter des Lipid-Öl-Gemisches werden in das Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das das 20-Mikroliter-Reaktionsgemisch enthält. Pipettieren Sie eine Minute lang kräftig auf und ab, um die Reaktion zu emulgieren. Schichten Sie die innere Emulsion vorsichtig auf die Ölschicht in der Tube.
10 Minuten bei 2000 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Pipettieren Sie anschließend vorsichtig das überschüssige Öl und die äußere Lösung aus dem Mikrozentrifugenröhrchen heraus. Mischen Sie das GUV-Pellet vorsichtig in die restliche Lösung, um es wieder zu suspendieren.
Übertragen Sie die GUV-Lösung zur Inkubation auf eine saubere 96-Well-Platte mit klarem flachem Boden. Übertragen Sie die versiegelte Platte in einen Plattenleser, um sie fünf bis sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius zu inkubieren. Stellen Sie die Platte nach der Inkubation auf ein inverses konfokales Mikroskop.
Fokussieren Sie sich auf einen interessierenden Bereich, der die GUVs enthält, und nehmen Sie dann die Bilder bei einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern auf. Speichern Sie die Bilder im TIFF-Format. Öffnen Sie die Bilder in einer Bildbearbeitungssoftware.
Klicken Sie auf das Einstellungsfeld für Helligkeit/Kontrast, um es zu öffnen. Passen Sie dann die Helligkeit und den Kontrast an, um die fluoreszierenden Proteine sichtbar zu machen. Die in GUV verkapselten zellfreien Expressionsreaktionen des Wildtyp-Glutamatrezeptors zeigten eine ausgezeichnete Expression und Membranlokalisation.
Der PRSP-Glutamatrezeptor neigte zur Aggregation und Punktbildung. Das lösliche sfGFP wurde in GUVS exprimiert und blieb im GUV-Lumen.
