Navigieren Sie zu dem Pfad, in dem das Experiment gespeichert ist. Die konvertierten TIFF-Dateien werden im selben experimentellen Ordner erstellt. Klicken Sie auf Plugins, dann auf 3D Suite und öffnen Sie die Optionen des 3D-Managers.
Aktivieren Sie im 3D-Manager-Fenster die Kontrollkästchen, die dem Volumen in Einheit, dem mittleren Grauwert, dem Begrenzungsrahmen in Pixel, dem Grauwert der Standardabweichung, dem Schwerpunkt in Pixel und dem Schwerpunkt in der Einheit entsprechen. Aktivieren Sie das Häkchen bei Objekte auf den Kanten XY ausschließen und auf den Kanten Z ausschließen.Klicken Sie dann auf OK. Öffnen Sie das Fluoreszenzbild der menschlichen T-Lymphozyten.
Klicken Sie auf Umschalttaste D, um den Proteinkanal einschließlich des Stapels zu duplizieren. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Hyper-Stack. Geben Sie die entsprechende Kanalnummer im Feld "Kanäle" an, und benennen Sie sie entsprechend um.
Um den Fiji Macro Recorder zu starten, navigieren Sie zu den Plugins, dann zu den Makros und wählen Sie Record. Um dann das FindFoci-Plugin zu öffnen, klicken Sie nacheinander auf die Plugins GDSC, FindFoci und FindFoci GUI. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü "Bild" das Bild aus, das analysiert werden soll.
Legen Sie die Gaußsche Unschärfe auf 1,5, die Hintergrundmethode auf die Standardabweichung über dem Mittelwert, den Hintergrundparameter auf neun, die Suchmethode auf den Bruchteil des Peak-Hintergrunds, den Suchparameter auf 0,7, die Peak-Methode auf relativ über dem Hintergrund, den Peak-Parameter auf 0,2 und die minimale Größe auf fünf fest. Legen Sie die maximalen Peaks auf hohe Werte fest, um alle Brennpunkte in das Bild einzubeziehen. Um die Identifizierung von Brennpunkten zu verbessern, passen Sie die Gaußsche Unschärfe in der Nähe des Brennweitendurchmessers an und erhöhen Sie die Werte des Hintergrundparameters, um strengere Schwellenwerte festzulegen.
Verringern Sie dann die Werte des Suchparameters, um Bereiche einzubeziehen, die weiter vom Fluoreszenzpeak entfernt sind, und verringern Sie die Werte des Peak-Parameters für die Trennung der Peaks. Führen Sie FindFoci aus, und kopieren Sie die Zeichenfolge, die im Rekorderfenster angezeigt wird. Die Zeichenfolge enthält die ausgewählten Parameter, ohne die Anführungszeichen.
Geben Sie für die Nukleus-Gaußsche Unschärfe den Wert von Sigma ein, der erforderlich ist, um das Bild für die Segmentierung weichzuzeichnen. Geben Sie dann die Zahl ein, die dem Kanal der interessierenden Färbung für den Proteinkanal entspricht. Fügen Sie im Parameter FindFoci die Zeichenfolge ein, die die Makroaufzeichnung der ausgewählten Parameter darstellt.
Aktivieren Sie das visuelle Kontrollkästchen und klicken Sie auf Durchsuchen, um das Verzeichnis auszuwählen, in dem die Bilder gespeichert sind. Nachdem alle Felder kompiliert wurden, klicken Sie auf OK, um die Ausführung fortzusetzen. Wählen Sie in der ROI-Liste im 3D-Fenster des ROI-Managers den Nuklei-Kanal aus und klicken Sie auf Live-ROI auf ein.
Wählen Sie den ROI aus, der zum selben Nukleus gehört, und drücken Sie auf merge. Und für unerwünschte Kerne drücken Sie die Entf-Taste. Klicken Sie erneut auf Live-ROI auf ein, wählen Sie alle aus und bestätigen Sie, dass alle Kerne korrekt segmentiert sind.
Öffnen Sie im Quantifizierungsordner die TXT-Datei mit den für die Analyse verwendeten Parametern. Öffnen Sie Google Colab in einem Browser. Wählen Sie dann in der Datei Notebook öffnen aus, und laden Sie die endgültigen Metriken für das Kernprotein hoch.
ipynb-Skript. Laden Sie alle Ordner, die die CSV-Dateien der einzelnen Bildfelder enthalten, in einen bevorzugten Ordner in Google Drive hoch. Geben Sie im Notebook den Pfad des Ordners an, in dem die Ergebnisunterordner gespeichert sind, und führen Sie alle Zellen aus.
Wenn die Kompilierung des Codes abgeschlossen ist, öffnen Sie die endgültige Tabellenkalkulationsdatei, die alle kompilierten Daten enthält.
