Platzieren Sie zunächst die trypsinisierte Sf1Ep-Zellkultur und eine 6-Well-Platte auf einer Arbeitsplattform. Geben Sie die entsprechende Anzahl von Sf1Ep-Zellen und Sf1Ep-Medium in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid über Nacht.
Kombinieren Sie die Komponenten von TpCM-2 in einem sterilen Behälter und fügen Sie Dithiothreitol als trockenes Pulver zu. Mischen und filtrieren Sie das Medium vorsichtig und sterilisieren Sie es mit einer 0,22-Mikrometer-Filtereinheit. Das Medium in einem anaeroben Gefäß voräquilibrieren, die Kammer mit dem Hausvakuum evakuieren und dreimal mit einem Gemisch aus 95 % Stickstoff und 5 % Kohlendioxid nachfüllen.
Dann mit 1,5 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid und Stickstoffgasgemisch auffüllen. Füllen Sie das Medium schnell in einen Tri-Gas-Inkubator, stellen Sie es auf 34 Grad Celsius auf und inkubieren Sie es über Nacht. Nach der Inkubation über Nacht nehmen Sie das Medium aus der Sf1Ep-Kultur und spülen die Zellen mit einem kleinen Volumen des voräquilibrierten TpCM-2.
Nachdem Sie die Spülung entfernt haben, fügen Sie eine angemessene Menge TpCM-2 hinzu und äquilibrieren Sie die Platte in 1,5 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid und balancieren Sie die Stickstoffatmosphäre drei bis vier Stunden lang bei 34 Grad Celsius aus. Entnehmen Sie die vorhandene T.pallidum-Kultur aus dem sauerstoffarmen Inkubator und untersuchen Sie die Sf1Ep-Zellschicht in jeder Vertiefung. Nachdem Sie die Zelldichte und das Aussehen aufgezeichnet haben, pipettieren Sie das Medium aus jeder Vertiefung in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Spülen Sie jede Rinne gut mit 0,35 Millilitern vorgewärmtem Trypsin-EDTA aus und geben Sie die Spülung in die 15-Milliliter-Tube. Geben Sie weitere 0,35 Milliliter Trypsin-EDTA in jede Vertiefung und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um Sf1Ep-Zellen von der Platte und T.pallidum von der Sf1Ep-Zelle zu entfernen. Kombinieren Sie nach der Ablösung die dissoziierten T.pallidum- und Sf1Ep-Zellen mit dem in dem konischen 15-Milliliter-Röhrchen gesammelten Reservemedium und notieren Sie das entnommene Gesamtvolumen für die Berechnung der Ausbeute pro Kultur.
Die zuvor vorbereitete Platte mit Sf1Ep-Zellen wird mit einem festgelegten Volumen des geernteten T.pallidum beimpft. Nach dem Austausch der Atmosphäre in der Platte bei 34 Grad Celsius im Brauglas oder in einem Tri-Gas-Inkubator inkubieren. Verwenden Sie nach der Inokulation eine Zählkammer, um T.pallidum unter Dunkelfeldmikroskopie zu zählen.
Geben Sie 50 % Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 10 % in die T.pallidum-Kultur und dispergieren Sie das Glycerin durch sanftes Pipettieren oder Inversion. Verteilen Sie die Zubereitung in ein bis zwei Milliliter Aliquoten in Gefrierfläschchen mit Schraubverschluss und stellen Sie die Fläschchen sofort in einen 80-Grad-Gefrierschrank oder einen Flüssigstickstoff-Gefrierschrank. Bereiten Sie zwei 96-Well-Platten mit 1000 Sf1Ep-Zellen und 200 Mikrolitern TpCM-2 pro Well vor und inkubieren Sie sie über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator.
Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium Sf1Ep durch TpCM-2, wie zuvor beschrieben. Nach der Quantifizierung verdünnen Sie T.pallidum in TpCM-2, um zwei Präparate mit Konzentrationen von 10 und 40 Zellen pro Milliliter herzustellen. Impfen Sie 50 Mikroliter pro Vertiefung des Präparats mit 10 T.pallidum pro Milliliter in eine der vorbereiteten 96-Ell-Platten.
In den beiden Kontrollvertiefungen in jeder Platte wird die 2 x 10 hoch drei T.pallidum pro Milliliter Verdünnung geimpft. Äquilibrieren Sie die Platten mit dem sauerstoffarmen Gasgemisch und inkubieren Sie sie in einem Brauglas oder Tri-Gas-Inkubator bei 34 Grad Celsius. Entfernen Sie am siebten Tag die Hälfte des Mediums und ersetzen Sie es durch frisches äquilibriertes TpCM-2.
Sobald die positiven Wells durch Dunkelfeldmikroskopie identifiziert wurden, trypsinisieren Sie die positiven Wells und übertragen Sie die Zellsuspension zur weiteren Expansion auf die zuvor vorbereiteten 24-Well-Platten. T.pallidum behält typischerweise eine Motilität von über 90 % bei und vermehrt sich logarithmisch mit einer Verdopplungszeit von 33 bis 45 Stunden für etwa sieben Tage, bevor sie in die stationäre Phase übergehen. Im Laufe einer Woche wurden die Spirochäten etwa vier bis fünf Mal verdoppelt.
