Tauen Sie zunächst kryokonservierte Oberflächenepithelzellen der menschlichen Eierstöcke auf. Mischen Sie die Zellen mit 10 Millilitern Waschmedium. Nach dem Zentrifugieren der Zellen resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern Oberflächenepithel der Eierstöcke oder OSE 2D-Medium und überführen Sie es in zwei Vertiefungen einer 12-Well-Platte.
Geben Sie einen Milliliter zusätzliches OSE 2D-Medium in die Vertiefung und kultivieren Sie es 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, bevor Sie das erste Medium erneuern. Verwenden Sie die Trypanblau-Färbung, um frisch isolierte oder kryokonservierte lebende lebende Oberflächenepithelzellen der menschlichen Eierstöcke mit einem automatisierten Zellzähler zu zählen. Mischen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen in einen Milliliter eiskaltes OSE-Organoid-Basismedium und zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 240 g.
Mit einer Pipette das Zellpellet in eiskalter, unverdünnter Basalmembran-Extraktlösung resuspendieren, um 10.000 Zellen pro 10 Mikroliter zu erhalten. Geben Sie 10 Mikroliter OSE-Basalmembran-Extraktlösung pro Vertiefung in einen vorgewärmten Objektträger mit mehreren Vertiefungen und legen Sie die Platte kopfüber bei 37 Grad Celsius in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid für 15 Minuten. Nachdem das Gel fest geworden ist, fügen Sie 100 Mikroliter OSE 3D-Medium hinzu und kultivieren Sie es bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.
Nachdem Sie das verbrauchte Medium entfernt haben, geben Sie 100 Mikroliter eiskaltes Advanced DMEM F12 in jede Vertiefung. Kratzen Sie mit einer P1000-Pipettenspitze den Boden der Vertiefungen ab, um die Geltröpfchen zu lösen, und geben Sie jedes schwimmende Geltröpfchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 240 g.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikrolitern Zelldissoziationspuffer und legen Sie die Röhrchen für 5 bis 10 Minuten in ein vorgewärmtes Bead-Bad bei 37 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter humanes OSE-Organoid-Basismedium hinzu und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 240 g. Zum Schluss resuspendieren Sie die Pellets in der gewünschten Menge unverdünnter Basalmembran-Extraktlösung, um sie in einem für die Kultivierung geeigneten Verhältnis neu zu säen.
Primäre humane OSE-Zellen zeigten bis zur dritten Passage eine kopfsteinpflasterartige Morphologie, zeigten danach aber Anzeichen von Seneszenz. Humane OSE-Organoide aus frisch isolierten OSE-Zellen wurden nach 14 Tagen in Kultur größer als solche aus 2D-expandierten OSE-Zellen. In 3D-OSE-Organoiden wurden verschiedene Morphologien beobachtet, darunter zystische, einschichtige, mehrschichtige und nicht-lumenisierte Zellcluster.
