Dieser Artikel wurde von NSERC Grant # 299280, IRSST als ein Stipendium an G. Eltern und FRSQ als ein Bachelor-Student Research Award an M. Cyr unterstützt. Wir bedanken uns bei Yoan Lemieux-Laneville für die Durchführung der Manipulationen auf Video aufgezeichnet.

<html> Vor jeder Manipulation, müssen Sie identifizieren die Gruppe der Sehnen verwendet je nach Experiment den Sie gerade führen und die Vorrichtung zu Ihrer Verfügung sein. Für unsere Zwecke wurden ventralen Sehnen gewählt, weil sie kleiner sind und somit leichter zu manipulieren, wenn die Messung der Querschnittsfläche auf und ergänzen sie in den Bioreaktor Kammer. Bitte beachten Sie, dass alle Instrumente autoklaviert oder sterilisiert mit 70% Ethanol. Darüber hinaus ist eine Sprühflasche mit 70% Ethanol neben jedem Arbeitsplatz aufgestellt, um die Experimentatoren Handschuhe vor jeder Operation zu sterilisieren. Teil 1: Extraction Nach der Resektion wird die Rute vorsichtig an den Extremitäten manipuliert, um eine Beschädigung des Gewebes. Auch die Erhaltung der Zellviabilität, sind alle Manipulationen in kalter Kochsalzlösung durchgeführt. 1A) Materialien: <ul><li> Kalter Kochsalzlösung (D-PBS) </li><li> Crushed Eis </li><li> Oberflächenschutz </li><li> Schneidbrett </li><li> Individuelle Manipulation Platten </li><li> 2 500 ml Speisen </li><li> 2 2L Glasschalen </li><li> Klebeband </li><li> 1 Pinzette </li><li> 1 Pinzette </li><li> 1 Pinzette stehen </li><li> 1 Paar OP-Schere </li><li> 1 Skalpell </li><li> 1 Paar OP-Schere <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Individual Manipulation mit Orientierung Identifikation (&quot;P&quot; für &quot;proximal&quot;) </li></ul> 1B) Work-Station: <ol><li> Breiten Sie die Oberfläche Beschützer und Stelle das Schneidebrett an der Spitze. </li><li> Füllen Sie jeweils zwei größeren Glasschalen zur Hälfte mit gestoßenem Eis und legen sie auf das Papier. </li><li> Stick ein Stück Klebeband an einer Ecke der Manipulation Platte und identifizieren sich mit einem Brief an den proximalen Ende geben. </li><li> Füllen Sie die beiden kleinen Glasschalen auf halbem Weg und alle Nuten der Manipulation Platten mit kalter Kochsalzlösung. Legen Sie sie in das große Glas-Schalen mit Eis. </li><li> Organisieren Sie alle sterilen Instrumenten auf der Oberfläche Beschützer. </li><li> Übertragen Sie die Rute in einer der Glas-Schale mit Kochsalzlösung. </li></ol> 1C) Manipulationen: <ol><li> Beachten Sie die Anatomie am proximalen Ende des Schwanzes, die Bauchseite von der Rückenseite zu unterscheiden. Die Bauchseite hat eine größere Anzahl von Sehnen und ein Blutgefäß, das durch leichtes Drücken der Schwanz bis zu winzigen Tropfen Blut zu produzieren überprüft werden kann. </li><li> Mit dem OP-Schere, schneiden Sie die Haut an der Dorsalseite des Schwanzes, wenn Sie die ventralen Sehnen (oder entlang der Bauchseite, wenn Sie die dorsalen Sehnen brauchen) extrahieren möchten. </li><li> Öffnen Sie den Schnitt am proximalen Ende und entfernen Sie die Haut mit einer Pinzette oder mit den Fingern und durch eine sorgfältige Manipulation der Schwanz endet. </li><li> Spülen Sie das Blut und die Haare in der Salzlösung und Transfer der Probe in den verbleibenden Glasschale mit frischen Lösung. Wechseln Sie die Handschuhe. Ein Transversalschnitt unter dem Lichtmikroskop zeigt die sechs Sehne Gruppen. Eine Sehne aus jeder Gruppe ist es, die kaudale Ende eines jeden Wirbel befestigt, so schneiden wir an der Bandscheibe zu neuen Sehnen entlang der Schnittlinie aussetzen. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Transversalschnitt der Rattenschwanz unter dem Lichtmikroskop. </li><li> Schneiden Sie das distale Ende durch den Knorpel 2-3 Wirbeln kürzer mit chirurgischer Schere. Setzen Sie den Schwanz auf dem Schneidebrett auf die Weichteile mit einem Skalpell und dann sofort wieder in den zugeschnittene Lösung. </li><li> Mit einer Pinzette herausziehen eine Sehne aus dem distalen Endstück. </li><li> Mit einem sanften halten an beiden Enden, statt der Sehne in die einzelnen Manipulationen Platte. Wiederholen Sie die letzten beiden Schritte, bis keine mehr Sehnen aus gehänselt werden können und schneiden ein Wirbel kürzer, wenn neue Gewebe ausgesetzt werden müssen. </li></ol> Teil 2: Querschnittsfläche Messung 7 Wenn das Gewebe mechanische Charakterisierung oder Stimulation erfährt, sind seine mechanischen Eigenschaften durch die Normalisierung der Kraft im Inneren der Sehne zu betonen, beschrieben. Deshalb haben wir Querschnittsfläche zu bewerten. 2A) Materialien: <ul><li> Optic Mikrometer </li><li> Stereomikroskop </li><li> Digitalkamera </li><li> Edge-Anerkennung und Profil Rekonstruktionsalgorithmen 5,6 </li><li> Kalter Kochsalzlösung (D-PBS) </li><li> 1 20-200 ul Micro Volumenpipette </li><li> 1 Hex Schlüssel für optische Mikrometer Anpassungen </li><li> 2 Pinzetten / Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg &quot;alt =&quot; Bild 3 &quot;/&gt; Abbildung 3. Optic Mikrometer </li></ul> 2B) Work-Station: <ol><li> Öffnen Sie die Software (Digital-Kamera und Algorithmen). </li><li> Legen Sie die Optik Mikrometer, so dass genügend Platz vorhanden ist, um die Sehne in der Apparatur zu laden. </li><li> Organisieren Sie die Instrumente und Glasschale mit den extrahierten Sehnen in der Nähe. </li></ol> 2C) Manipulationen: <ol><li> Füllen Sie den Mess-Fach mit kalter Kochsalzlösung, bis beide Anker-Systeme untergetaucht sind. </li><li> Transfer der Sehne in das Fach, indem Sie die Enden mit einer Pinzette. </li><li> Mit Saug über die Mikro-Volumen Pipetten, ziehen eine Extremität in einer Zeit, in der Silizium-Rohr. Saugen Sie bis zum Ende erstreckt sich über die Welle Kragen. </li><li> Ziehen Sie die Stellringe an den Rohren zu komprimieren und installieren Sie das Gerät unter dem Stereomikroskop. </li><li> Bei 105X Vergrößerung, erstrecken sich die Sehnen unter Beachtung der Gewebe, bis die Falten nicht mehr wahrnehmbar sind. Stretch von zusätzlichen 0,40%. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Tendon Projektion bei 105x Vergrößerung vor und nach dem Dehnen. </li><li> Stellen Sie Position und Fokus auf ein klares Bild von der Sehne über einen 180 °-Drehung zu halten. </li><li> Nehmen Sie ein Foto an alle 10 °-Drehung ohne Änderung Spannung, Fokus oder Position. Verwenden Sie nur die Welle für die Durchführung der Rotation. Wegen seiner Kegelform, können Sie diese Schritte an verschiedenen Punkten entlang der Sehne wiederholt werden. </li><li> Aktivieren Sie den Rand Anerkennung und Profil Rekonstruktionsalgorithmen, um die Datenbank, die Sie sich registriert haben zu analysieren. </li><li> Befreien Sie die Sehne durch Lösen der Welle Kragen und Einblasen von Luft in die Silikonschläuche mit dem Mikro Volumenpipette. </li><li> Setzen Sie die Sehne auf die Manipulation Platte wieder Handhabung durch den Enden. </li><li> Überprüfen Sie die Form des Profils Wiederaufbau erhalten und den Wert der Querschnittsfläche. </li></ol> Teil 3: Spülen So entfernen Sie Verunreinigungen, die während der vorangegangenen Manipulationen stattgefunden haben kann, sind die Gewebe unter Biosicherheitswerkbank gespült. 3A) Materialien: <ul><li> Kalter Kochsalzlösung (D-PBS) </li><li> Multiple-Nut Manipulation Platte </li><li> Individuelle Manipulation Platten </li><li> Klebeband </li><li> 2 Pinzetten </li><li> 1 Pinzette stehen </li></ul> 3B) Work-Station: <ol><li> Schalten Sie den Lüfter in der Biosicherheitswerkbank 15 Minuten im Voraus und reinigen Sie die Innenflächen mit 70% Ethanol. </li><li> Bringen Sie alle Instrumente im Inneren des Biosicherheitswerkbank. </li><li> Stick-Klebestreifen auf einer Ecke der einzelnen Platte mit dem proximalen Ende zu identifizieren. </li><li> Füllen Sie alle Rillen mit steriler Kochsalzlösung. </li></ol> 3C) Manipulationen: <ol><li> Führen Sie die Manipulation Platte mit den extrahierten Sehnen in den Schrank. </li><li> Mit einer Pinzette entfernen Sie die Sehne von ihrem Teller mit einem sanften Griff an jedem Ende. </li><li> Tauchen und sanft rühren die Sehne in der Salzlösung jedes Fach des Multiple-Nut Manipulation Platte, beginnend mit dem nächsten und Verfahren, um die am weitesten Nut. </li><li> Schließlich tauchen die Sehne in eine individuelle Manipulation Platte. </li></ol> Teil 4: Laden in Bioreaktor Kammer Zur Vermeidung weiterer Kontaminationen, sind die folgenden Manipulationen auch im Biosicherheitswerkbank durchgeführt. 4A) Materialien: <ul><li> Bioreaktor Kammer 4 </li><li> Sterile Anker </li><li> 1 Steriles Petrischale </li><li> Kalte Zelle kultivierten Medium (DMEM) </li><li> Cyanacrylat </li><li> 2 Pinzetten </li><li> Pinzetten stehen </li><li> 0,5-10 &amp;mgr; l Micro-Volumenpipette </li><li> 1 Lineal <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Bioreaktor Kammer </li></ul> 4B) Work-Station: <ol><li> Seit dem letzten Schritt wurde auch in Biosicherheitswerkbank realisierte Abbau unnötiger Tools geben Ihnen mehr Platz zum Arbeiten. </li><li> Bringen Sie alle anderen Instrumente im Schrank. </li></ol> 4C) Manipulationen: <ol><li> Legen Sie einen Anker auf die Manipulation Platte mit seiner Spule über der Sehne Extremität zentriert und Wunde im Gewebe und um die Spule. </li><li> Rollen Sie den Anker über und halten Sie die lose Extremität gleichzeitig sicherzustellen, dass das Gewebe an der Anker bleibt. Stop nach ¾ abbiegen. </li><li> Führen Sie das GleicheSchritte mit dem anderen Ende. </li><li> Roll beide Anker über gleichmäßig, bis es 6 cm zwischen den Zentren 1. </li><li> Lösen der Sehne, um es in die Lösung eintauchen und damit die Verankerung Abschnitten kurz antrocknen seiner mechanischen Eigenschaften 2-3 erhöhen. </li><li> Gießen Sie in der Petrischale Cyanacrylat und zeichnen 2.5μL in die Mikro-Volumen Pipetten. </li><li> Einen Tropfen Cyanacrylat auf die Wunde-up Gewebe ohne Sturz eines Klebers in der Salzlösung. Wiederholen, bis 2 Tropfen auf jeder Anker angewendet wurden. </li><li> Mit der Sehne noch völlig eingetaucht, 5 Minuten warten, bis der Kleber vollständig trocknen. </li><li> Während dieser Zeit füllen die Kammer Fach mit Kochsalzlösung. </li><li> Rehydrieren alle Gewebe mit Kochsalzlösung, um Schäden zu verhindern. </li><li> Durch die Manipulation nur die Anker, Transfer der Sehne in den Bioreaktor Kammer und schließen Sie es, um ein Auslaufen und Verschmutzung während der Übertragung zu verhindern. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse: Das Ergebnis des Protokolls zeigt, dass, wenn richtig durchgeführt, unsere Gewebe strenger Isolierung und Herstellung Verfahrens es möglich, Gewebe Sterilität, die Lebensfähigkeit und Integrität aufrecht zu erhalten. Der erste ist, die einfache und repetitive Extraktionsmethode, können wir bis zum Schwanz Sehnen ohne Beschädigung der Kollagen-Netz, wie es durch eine mikroskopische Analyse von H &amp; E tainted Abschnitte nach der Extraktion realisiert beobachtet werden können extrahieren. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Tendon Kollagen-Netzwerk nach der Extraktion (5 um Längsschnitt mit H &amp; E gefärbten). Wir haben dann kultiviert Sehnen für bis zu 10 Tage und führte Sterilitätstests. Jeder Tag, inkubierten wir vernickelt verwendet Nährlösung auf Agar und es für 24 Stunden. Da kein bakterielles Wachstum beobachtet wurde, schlossen wir, dass unsere Manipulationen nicht zu einer Kontamination führen. Mit dem Profil Rekonstruktionsalgorithmus und optische Mikrometer, sind wir in der Lage, die Querschnittsfläche innerhalb einer Marge von 2% der Fehler 7 zu schätzen. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Profil Rekonstruktion eines RTT. Schließlich untersuchten wir die Lebensfähigkeit unter Verwendung des LIVE / DEAD Lebensfähigkeit / Zytotoxizität Kit für Säugerzellen nach dem Spülvorgang und nach zwölf Tagen Kulturdauer. Da eine große Mehrheit des grün fluoreszierenden lebenden Zellen erkennbar waren, können wir bestätigen, dass unser Verfahren zur Isolierung von erfolgreich Aufbewahrung lebender Gewebe. Der gleiche Test wurde zwei Stunden nach dem Anbringen der Sehne in den Bioreaktor Kammer durchgeführt. Wir Nachweis erbracht, dass die Entwässerung und kleben an der Anker noch nicht in das Gewebe zwischen den beiden Anker zu verbreiten. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Abbildung 8" /> Abbildung 8. Tissue Lebensfähigkeit der Anker (grün = lebende Zellen, rot = tote Zellen)

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	<li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons.">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li><li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> D&#233;shydratation de matrices collag&#233;niques reconstruites in vitro: effets sur les propri&#233;t&#233;s m&#233;caniques et histologiques [dissertation]. , 114-114 (1981).</li><li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon.">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li><li>Hupp&#233;, N., Lessard, J. -. L., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bioreactor+Design+for+the+Mechanobiological+Study+of+Soft+Tissue+Damage+and+Repair+in+Conditions+that+Provide+the+Best+Approximation+of+Actual+Use.">A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use.</a> , (1985).</li><li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements.">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li><li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues.">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li><li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Techniques+for+the+Evaluation+of+Cross-Sectional+Area+in+Rat+Tail+Tendons+Generate+Significant+Errors.">Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors.</a> , (1985).</li></ol>

Durch die Anwendung dieser experimentellen Verfahren, können wir eine Vielzahl von in vitro Studien durchführen zu dieser Art von Geweben. Da war zum Beispiel eine Studie über Gewebedegeneration durch die Anwendung der unter-Stimulation RTT für einen Zeitraum von zehn Tagen zu erfolgen. Jeder Tag, wir Gewebe mechanische Eigenschaften in nicht-destruktive Spannungsrelaxation Tests ausgewertet. Am Ende konnten wir RTT Spannungsverlauf zu beobachten und damit zu analysieren den Verlauf der mechanischen Eigensc...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-PBS </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>311-410-CL</td>
<td>Saline solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc. </td>
<td>609-037-EL </td>
<td>Saline solution
 1g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics </td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062 </td>
<td>Saline solution
 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>12800-017</td>
<td>Culture solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>600-105-CG</td>
<td>Culture solution 3.7g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>090150</td>
<td>Culture solution 10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062</td>
<td>Culture solution 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>Optic Micrometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulation plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioreactor chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies

Rattenschwanzsehnen (RTT) sind ein gemeinsames biologisches Modell in experimentellen in vitro-Studien eingesetzt in den Bereichen Sehne Physiologie und Tendopathie. Arbeiten mit diesen Geweben ist eine Herausforderung, weil sie sehr empfindlich sind, und bis jetzt gab es keine streng detailliertes Protokoll für die Isolation. Angesichts dieser Herausforderungen haben wir Methoden und Instrumente entwickelt, um Manipulationen von RTT und Kontrolle Gewebeviabilität, Sterilität und Unversehrtheit zu erleichtern. Dieser Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur RTT für biomechanische und mechanobiological Studien vorzubereiten. Extraktion, Querschnittsfläche Messung, Spülen und Laden in den Bioreaktor Kammer: Unsere Arbeit ist in vier Hauptbereiche unterteilt. Bei jedem Schritt werden alle Verfahren, Materialien und Manipulationen im Detail vorgestellt, so dass sie leicht reproduziert werden kann. Darüber hinaus sind die spezifischen Instrumente entwickelt vorgestellt: eine Manipulation Platte verwendet werden, um RTT zu trennen, eine optische Mikrometer, um das Gewebe während der Querschnittsfläche Messung und eine Verankerung der Lage, die RTT auf einen Bioreaktor befestigen. Schließlich beschreiben wir die Ergebnisse nach mehreren Tests erhalten unsere Methoden zu validieren. Die Lebensfähigkeit, Sterilität und Unversehrtheit Auswertungen zeigen, dass unser Verfahren streng genug für Manipulationen fragile Gewebe wie Rattenschwanzsehnen sind.

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Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Dieser Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur Rattenschwanzsehnen für biomechanische und mechanobiological Studien vorzubereiten. Einige Funktionen der wichtigsten Schritte in Vorbereitung sind nachgewiesen, beginnend mit der Extraktion Querschnittsfläche Messung, Spülen und Laden in den Bioreaktor Kammer.

Vorbereitung der Rattenschwanzsehnen für Biomechanik und Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Aufrufe.  Université de Sherbrooke. Dieser Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur Rattenschwanzsehnen für biomechanische und mechanobiological Studien vorzubereiten. Einige Funktionen der wichtigsten Schritte in Vorbereitung sind nachgewiesen, beginnend mit der Extraktion Querschnittsfläche Messung, Spülen und Laden in den Bioreaktor Kammer.

Serie: Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Interview: Protein Folding and Studies of Neurodegenerative Diseases

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

Interview: Proteinfaltung und Studien für Neurodegenerative Erkrankungen

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the ...

Forschung

Biologie

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Herstellung von Ratten-Gehirn-Aggregate Kulturen für Neuron und Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  Following division, these cells migrate posteriorly, where FGF diffusing from the retina induces them to differentiate into a posterior array of elongated lens fiber cells, which compose the bulk of the lens.  Differentiation of lens epithelial cells into lens fibers can be induced in vitro by culturing explants of the central region of the anterior epithelium in the presence of FGF-2.  Explants are prepared from lenses of neonatal rats by removing the lens from the eye and grasping the lens capsule on the posterior side with dissecting tweezers.  The posterior capsule is then gently torn open and pressed down into the plastic bottom of a tissue culture dish. The peripheral regions of the explant are removed with a scalpel and the central area is then cultured in the presence of 100ng/ml FGF-2 for as long as 2-3 weeks, depending on the parameters to be studied.  Since epithelial cells in cultured explants differentiate in approximate synchrony over a period of days to weeks, the time course of signaling and gene expression can be determined using molecular, biochemical, and pharmacological techniques.  Immunofluorescence microscopy is a powerful adjunct to these methods as it demonstrates the subcellular localization of proteins of interest and can reveal the physiological consequences of experimental manipulations of signaling pathways.

Explants of the central region of rat lens epithelia differentiate synchronously when cultured in the presence of FGF-2. Immunofluorescence microscopy of such cultures can provides novel information about gene expression and signaling events associated with terminal differentiation.

Vorbereitung und Kultur der Rat Linsenepithelzellen Explantate für ein Studium der terminalen Differenzierung

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Herstellung von hoch Coupled Rat-Mitochondrien

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Herstellung von Ratten Serum Geeignet für Säugetier Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Blutprobenentnahme aus der laterale Schwanzvene der Ratte

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

Eine zweistufige Strategie, die epigenetische Modifikation und biomechanische Hinweise kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...