Nos gustaría dar las gracias a Amsale Belay por su ayuda en la filmación de este artículo de vídeo. Este trabajo fue financiado por CIHR, NSERC y subvenciones CRC a JDL.

Parte 1. Preparación de filete de la población adulta del abdomen de Drosophila. El procedimiento que se describe a continuación inmediata prepara el abdomen de la posterior retirada de la oenocytes (ver Parte 2 del protocolo). El mismo procedimiento se puede utilizar para la preparación de los tejidos que están conectados a la superficie interna de la cutícula, incluyendo el vaso dorsal (es decir, del corazón) y la grasa corporal. Tenga en cuenta que en el artículo de vídeo de la técnica de disección oenocyte se demuestra en un adulto de tipo salvaje (Cantón-S) mosca macho, de seis días de edad. Técnicas idénticas se puede utilizar para quitar el oenocytes de las moscas hembras. La preparación de filete abdomen tarda aproximadamente 5 minutos para llevar a cabo. Antes de comenzar es importante tener a mano varios pines disección fina (ver más abajo y Parte 2) y una aguja de disección (véase la Parte 2). Pines disección disponibles en el mercado y las agujas son a menudo demasiado grandes para este protocolo, por lo que hemos tomado para fabricar nuestro propio laboratorio. Para crear la aguja de disección, de alambre de tungsteno (0.005 &quot;) es el primero pasa a través del eje de la aguja hipodérmica (27G, aluminio hub). Pase el cable a través de la punta de la aguja hipodérmica para que emerge desde el centro. Unir el hilo salientes desde el centro;. esto evita que el cable se salga de la aguja hipodérmica A continuación, cortar el alambre en el extremo opuesto de la que como engarce de varios milímetros (~ 3 a 4 mm) de cable sobresalga de la punta de la aguja hipodérmica pasar. la punta de tungsteno expuestos a través de una llama afinar el cable a un punto muy bien. Una pipeta de 5 ml de plástico desechable cuando incrustado en el centro de la aguja hipodérmica actúa como manejar esta herramienta conveniente para la disección. Los pasadores de la disección fina se realizan en una situación similar manera. Después del paso de afilar, agarrar la punta del cable firmemente con unas pinzas para evitar que se mueva y haga un corte de aproximadamente 3 mm de la punta para liberar el pin pequeña disección. Tenga cuidado para evitar pin de ser arrojado del poder de las pinzas. De filete de preparar el abdomen adulto de Drosophila: <ol><li> Asegurar la marcha a la plancha de disección (Sylgard, Dow-Corning) mediante la colocación de un perno de la disección bien, aunque el tórax. </li><li> Quitar las patas y las alas de la mosca. Mientras se quita el conjunto más posterior de las piernas, crear una abertura en la cutícula en el momento justo anterior a donde se reúne el tórax del abdomen. Esta apertura se utiliza después como un punto de acceso para realizar una incisión a lo largo de la superficie ventral del abdomen (ver paso 5) </li><li> Asegurar el abdomen de la mosca en su lugar mediante la colocación de un perno de la disección de segundo a través del segmento genital. </li><li> Cubrir la marcha con escudos refrigerados y Sang M3 medio de insectos (Sigma). Eliminar el aire atrapado por su elaboración con una pipeta Pasteur. </li><li> Utilizando unas pinzas para abrir el abdomen mediante una incisión a lo largo de la línea media ventral de la abertura de la cutícula creado por la eliminación de las piernas para el segmento genital. Retire las vísceras y las gónadas del abdomen. </li><li> Cortar la cutícula y la tráquea que conecta el abdomen al tórax. El único tejido que conecta el resto de abdomen al tórax debe ser el corazón. Esto proporciona la cutícula del abdomen con una cierta estabilidad, y evita que gire o girar en el siguiente paso. </li><li> Patas planas la anterior mayoría de los rincones de la cutícula abdominal. Quitar el tórax. Tirando de la cutícula tensa, pines planos de las esquinas posteriores de la cutícula. El pasador en el segmento genital puede ser necesario volver a colocar para que la cutícula quede plano. </li></ol> Parte 2. Disección Oenocyte La preparación de filete abdomen expone la superficie interna de la cutícula del abdomen y los tejidos fijos, incluyendo el corazón, la grasa corporal, tráquea, músculos de la pared del cuerpo, la epidermis y la oenocytes. El corazón se encuentra a lo largo de la línea media dorsal. De grasa corporal (tejido opaco) cubre la mayor parte de la superficie cuticular interna. Tráqueas (blanco estructuras tubulares) se extienden desde las aberturas espiráculo lateral, y que las ramas extensas que se infiltran en los tejidos. Que yace bajo estos tejidos, el oenocytes pigmentada (de color ámbar, las células) se irradian desde la línea media hasta el borde lateral de la cutícula en la región posterior de cada segmento. El oenocytes encuentran directamente bajo la oscura curtida regiones de cada terguito (dorsal placas cuticulares) y pueden ser difíciles de identificar sin un conocimiento previo de su localización. Otra población de oenocytes ventralmente encuentra está asociado con el esternitos (ventral placas cuticulares), a pesar de que es posible aislar estas células, este protocolo de vídeo sólo demostrar la disección de la oenocytes dorsal. En cada segmento abdominal, una hoja destacada de tejido de grasa corporal se encuentra por delante de la oenocytes, una hoja más pequeña menos obvios de la grasa corporal se encuentra por detrás de la oenocytes. La hoja prominentes de tejido de grasa corporal a menudo cubre la oenocytes del segmento que lo precede. El vaso dorsal y la grasa corporal se debe quitar en primer lugar para exponer la oenocytes. Es importante señalar que la pigmentación de color ámbar de la oenocytes, de la que deriva su nombre (eno - del griego oinos, «vino») 1, distingue claramente estas células de los tejidos circundantes, la intensidad de la pigmentación aumenta con la edad de la mosca. Por otra parte, una lámina basal ensheathes el 2,3 oenocytes, proporcionando apoyo a los grupos de células y la prevención de las células se conviertan en disociada durante la disección. La lámina basal también ayuda en la eliminación de los tejidos extraneously adherido, como el tejido de grasa corporal, mediante la creación de un punto débil en estas adherencias pueden ser fácilmente alteradas. El procedimiento descrito a continuación se proporcionan instrucciones detalladas para la retirada de la oenocytes del tegumento abdominal. El oenocytes se puede quitar fácilmente de los segmentos abdominales 2-5 (varones) y 2-6 (femenino). El oenocytes de los segmentos abdominales primero y el último (segmentos 1 y 6 en hombres y 7 en mujeres) son a menudo interrumpido por los pasadores de la disección de la celebración de las esquinas de la cutícula y por lo tanto, se evitan. La eliminación de la oenocytes tarda aproximadamente 10 minutos para llevar a cabo. Para aislar el oenocytes adultos: <ol><li> Sever los troncos traqueales que emanan de los espiráculos utilizando una aguja de disección. </li><li> Retire la grasa en el cuerpo y el corazón por la ruptura de las conexiones a la superficie interna de la cutícula con una aguja de disección. Para ello, la posición de la punta de la aguja de disección entre la grasa corporal y la oenocytes, y se arrastra desde el borde lateral de la cutícula, a través de la línea media, pasando por debajo del corazón, y continuando hacia el lado opuesto. Progresando desde el posterior a anterior, retirar el tejido de grasa corporal y el corazón de la cutícula de cada segmento sucesivo. Si se realiza con cuidado el oenocytes permanecer unidos a la cutícula, y la grasa en el cuerpo y el corazón se puede quitar todo. </li><li> Los músculos de la pared del cuerpo de la correa de oenocytes a la superficie interna de la cutícula. Con la aguja de disección de cortar los músculos del cuerpo longitudinal de la pared de cada segmento. Para ello, arrastre la aguja de disección a lo largo de la parte posterior de la cadena oenocyte, suavemente levantar de la superficie de la cutícula. Las hebras oenocyte de cinta debe salir de la cutícula y se puede colocar a un lado mientras que el resto de oenocytes se eliminan. </li><li> Una vez retirado de la cutícula y la mentira en la placa de la disección puede ser necesario para limpiar cualquier adherido a los tejidos de grasa corporal de la oenocytes. Esto se hace simplemente colocando la aguja de disección entre el tejido de grasa corporal y oenocytes, y cortar la conexión al empujar la aguja hacia abajo y contra la placa de disección. </li><li> Reúne los hilos oenocyte con sólo meter la punta de la aguja de disección. Una vez pegado a la punta de la aguja de disección de la oenocytes se puede tirar lentamente a través de la superficie del medio de cultivo. El oenocytes disecados se pueden colocar directamente en el buffer de lisis celular apropiado para el RNA o la extracción de proteínas. Tenga en cuenta que la oenocytes (segmentos abdominales 2-5) de una mosca macho produce normalmente de 15 20ng de ARN total. </li></ol> Figura la leyenda: <img src="/files/ftp_upload/2242/2242fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Expresión de los genes desaturasa, desat1 y desatF, en oenocytes macho y hembra de D. melanogaster. transcripción inversa-PCR de amplificación de desat1 y desatF de ADNc derivados de adultos oenocytes hombres y mujeres. El gen desat1 se expresa tanto en oenocytes hombres y mujeres, expresión desatF es dimorfismo sexual, que se expresa exclusivamente en oenocytes femenino. Correspondientes a estas diferencias en la expresión génica, desat1 se requiere para la producción de compuestos de hidrocarburos comunes a los dos hombres y 9 mujeres, y desatF está involucrado en la producción de compuestos de hidrocarburos específicos de la mujer 10,11. DesatF se ha demostrado que se expresa específicamente en oenocytes mujeres en 12 por hibridación in situ. Tenga en cuenta que en promedio de 15 20ng de ARN total se obtiene de la oenocytes disecados de un vuelo individual. RNA fue aislado utilizando el RNeasy kit micro (Qiagen), cDNA fue producida usando el qScript cDND síntesis kit (Quanta BioSciences)

<ol>
	<li>Wielowiejski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ueber+das+blutgewebe+der+insekten.">Ueber das blutgewebe der insekten.</a> Zeit. Wiss. Zool. 43, 512-536 .</li><li>Krupp, J. J., Kent, C., Billeter, J. C., Azanchi, R., So, A. K., Schonfeld, J. A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+experience+modifies+pheromone+expression+and+mating+behavior+in+male+Drosophila+melanogaster.">Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster.</a> Curr. Biol. 18, 1373-1383 (2008).</li><li>Locke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+membranes,+Golgi+complexes,+and+vacuolar+systems.">Surface membranes, Golgi complexes, and vacuolar systems.</a> Annu. Rev. Entomol. 48, 1-27 (2003).</li><li>Billeter, J. C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+cells+tag+sexual+and+species+identity+in+Drosophila+melanogaster.">Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 461, 987-991 (2009).</li><li>Gould, A. P., Elstob, P. R., Brodu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+oenocytes:+a+model+system+for+studying+cell-fate+specification+by+Hox+genes.">Insect oenocytes: a model system for studying cell-fate specification by Hox genes.</a> J. Anat. 199, 25-33 (2001).</li><li>Lawrence, P. A., Johnston, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+of+the+Drosophila+abdomen:+the+epidermis,+oenocytes+and+ventral+muscles.">Cell lineage of the Drosophila abdomen: the epidermis, oenocytes and ventral muscles.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 72, 197-208 (1982).</li><li>Johnson, M. B., Butterworth, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+and+aging+of+adult+fat+body+and+oenocytes+in+Drosophila+as+revealed+by+light+microscopic+morphometry.">Maturation and aging of adult fat body and oenocytes in Drosophila as revealed by light microscopic morphometry.</a> J. Morphol. 184, 51-59 (1985).</li><li>Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+hepatocyte-like+cells+regulate+Drosophila+lipid+metabolism.">Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism.</a> Nature. 445, 275-280 (2007).</li><li>Marcillac, F., Bousquet, F., Alabouvette, J., Savarit, F., Ferveur, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+with+major+effects+on+Drosophila+melanogaster+sex+pheromones.">A mutation with major effects on Drosophila melanogaster sex pheromones.</a> Genetics. 171, 1617-1628 (2005).</li><li>Chertemps, T., Duportets, L., Labeur, C., Ueyama, M., Wicker-Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+female-specific+desaturase+gene+responsible+for+diene+hydrocarbon+biosynthesis+and+courtship+behaviour+in+Drosophila+melanogaster.">A female-specific desaturase gene responsible for diene hydrocarbon biosynthesis and courtship behaviour in Drosophila melanogaster.</a> Insect Mol. Biol. 15, 465-473 (2006).</li><li>Legendre, A., Miao, X. X., Da Lage, J. L., Wicker-Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+desaturase+involved+in+female+pheromonal+cuticular+hydrocarbon+biosynthesis+and+courtship+behavior+in+Drosophila.">Evolution of a desaturase involved in female pheromonal cuticular hydrocarbon biosynthesis and courtship behavior in Drosophila.</a> Insect. Biochem. Mol. Biol. 38, 244-255 (2008).</li><li>Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+sex+pheromone-producing+enzyme+expression+in+Drosophila.">Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila.</a> PLoS Biol. 7, e1000168-e1000168 (2009).</li></ol>

En este artículo de vídeo se presenta un protocolo de disección detallada para la preparación de la oenocytes de adultos de D. melanogaster de una manera adecuada para el análisis molecular. Un texto basado abreviado en cuenta el método de disección ha sido descrito en otra 2, y la preparación resultante oenocyte ha demostrado ser adecuado para la extracción de ARN y proteínas 2. El uso de este preparado también puede ser posible desarrollar métodos para el cultivo de oenocytes...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten Wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella, Inc.</td>
<td>27-11</td>
<td>0.005&#x201D;/20&#x2019;</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont</td>
<td>11252-30</td>
<td>#5</td>
</tr>
<tr>
<td>Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3652</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>qScript cDNA Synthesis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quanta Biosciences</td>
<td>95047-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monoject Hypodermic Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>722289</td>
<td>20G1 with aluminum hub</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of oenocytes from adult drosophila melanogaster

En<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Como en otros insectos, una capa de cera sobre la superficie exterior de la cutícula, compuesto principalmente de compuestos de hidrocarburos, proporciona protección contra la desecación y otros problemas ambientales. Varios de estos compuestos de hidrocarburos cuticulares (CHC) también funcionan como señales de semioquímicos, y como tal mediar comunicación feromonal entre los miembros de la misma especie, o en algunos casos entre las diferentes especies, y el comportamiento de influencia. Las células especializadas a que se refiere como oenocytes son consideradas como el sitio principal para la síntesis de CHC. Sin embargo, se sabe relativamente poco sobre la participación de la oenocytes en la regulación de la biosíntesis, transporte y deposición de las vías que contribuyen a la producción de CHC. Teniendo en cuenta el importante papel que juegan los CSC en varios aspectos de la biología de los insectos, incluyendo la comunicación química, resistencia a la desecación, y la inmunidad, es importante para obtener una mayor comprensión de la regulación molecular y genética de la producción de CHC dentro de estas células especializadas. El oenocytes adultos de<em&gt; D. melanogaster</em&gt; Se encuentran en el tegumento abdominal, y se metamerically dispuestos en forma de cinta grupos irradiado a lo largo de la superficie interior de la cutícula de cada segmento abdominal. En este artículo de vídeo que demuestran una técnica de disección utilizados para la preparación de oenocytes de los adultos<em&gt; D. melanogaster</em&gt;. En concreto, ofrecemos un detallado paso a paso la demostración de (1) la forma de preparar filete de un adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Abdomen, (2) la manera de identificar la oenocytes y discernir los de otros tejidos, y (3) cómo quitar intacta grupos oenocyte del tegumento abdominal. Una breve ilustración experimental de cómo esta preparación se puede utilizar para examinar la expresión de genes implicados en la síntesis de hidrocarburos se incluye. La preparación disecada demostrado en este documento permitirá el análisis detallado moleculares y genéticos de la función oenocyte en la mosca de la fruta adultas.

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Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

En los insectos, el oenocytes producir compuestos cuticulares de hidrocarburos. Estos compuestos protegen contra la desecación y facilitar la comunicación química. Aquí se demuestra una técnica de disección para aislar el oenocytes de los adultos<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Y muestran cómo esta preparación se puede utilizar para estudiar los genes implicados en la síntesis de hidrocarburos.

La disección de Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

20.3K vistas.  University of Toronto. En los insectos, el oenocytes producir compuestos cuticulares de hidrocarburos. Estos compuestos protegen contra la desecación y facilitar la comunicación química. Aquí se demuestra una técnica de disección para aislar el oenocytes de los adultos Drosophila melanogaster, Y muestran cómo esta preparación se puede utilizar para estudiar los genes implicados en la síntesis de hidrocarburos.

Video: Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Investigación

Biología

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

La disección de los discos imaginales de 3er estadio las larvas de Drosophila

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

Las grabaciones de células enteras del cerebro del adulto de Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Vídeo de alta resolución de Seguimiento de la locomoción en adultos de Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

La disección de Gyrus dentado del hipocampo de ratones adultos

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

Inyección de insulina y extracción hemolinfa para medir la sensibilidad a la insulina en adultos Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medición de la esperanza de vida en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

La disección y la inmunotinción de imaginal discos de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...