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1. Vorbereitung der Sylgard bedeckten Teller, experimentelle Kammern und Rasierklingen <ol><li> 35 mm Falcon Petrischalen mit Sylgard Elastomer beschichtet sind für die ordnungsgemäße Hacken eines isolierten Netzhaut auf einzelne Sehzellen erhalten benötigt. Das Elastomer wird nach den Anweisungen des Lieferanten und eine kleine Menge in jede Schale gegossen, um dessen Boden mit einer Schicht bedecken vorbereitet. Ersetzen Sie die Antenne deckt nach der Beschichtung und speichern sie. In ein paar Tagen wird das Elastomer aushärtet und die Speisen sind fertig. </li><li> Isolierte Photorezeptoren müssen auf dem Boden des experimentellen Kammer-Stick, so dass sie im Laufe eines abbildenden Experiment immobilisiert sind. Dies wird durch die Beschichtung der Böden der Kammern mit Poly-L-Lysin oder Poly-L-Ornithin erreicht. Geben Sie 200 ul von 0,01% Lösung von entweder eine pro Kammer, und decken die Kammern mit einem Papiertuch, um sie vor Staub zu schützen. Nachdem die Lösung getrocknet ist, waschen Sie die Kammern mit destilliertem Wasser und lagern in einer geschlossenen Box. Verwenden Sie innerhalb von 2 Wochen. </li><li> Zum Reinigen der Kammern am Ende eines Experiments, waschen Sie sie mit 100% Ethanol, kein Öl aus der Öl-Immersions-Objektiv und Zelltrümmer zu entfernen. Zum Entfernen der Zelltrümmer, verwenden Wattestäbchen und vorsichtig schrubben den Boden der Kammer. Anschließend mit destilliertem Wasser zu waschen und lassen die Kammern trocknen, bevor re-Beschichtung. </li><li> Cut zweischneidiges Rasiermesser in kleine Stücke (8 von einer Klinge) mit einem Metall-Cutter. </li></ol> 2. Herstellung der Lösungen <ol><li> Die Zusammensetzung der Lösungen hängt von der Spezies. Für Amphibien hat der Ringer (in mmol / L): 110 NaCl, 2,5 KCl, 1,6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 HEPES, pH = 7,55. Der pH-Wert sollte auf den endgültigen Wert mit NaOH eingestellt werden. Für Säugetiere, hat die Ringer-(in mmol / L): 130 NaCl, 5 KCl, 0,5 MgCl 2, 2 CaCl 2, 25 hemisodium-HEPES, pH = 7,40. Die Ringer-Lösung kann bei Raumtemperatur aufbewahrt gut verschlossen für ein paar Monate. </li><li> Lager Glucose-Lösung, 1 mol / L, bei -20 ° C gehalten, um das Bakterienwachstum zu verhindern. </li><li> Am Tag des Experiments, fügen Glukose zu der Ringerlösung auf eine Endkonzentration von 5 mmol / L. Am Ende des Tages, entsorgen Sie die Ringer, die Glukose enthält, da es Bakterien könnte wachsen. </li></ol> 3. Isolation der Netzhaut <ol><li> Für die ordnungsgemäße Entfernung der Netzhaut ist es wichtig, dass das Tier für mindestens 2-3 Stunden vor der Tötung dunkel angepasst werden. Die Tiere sollten dunkel sein angepasst in einen geeigneten Behälter belüftet in der Dunkelkammer. </li><li> Füllen Sie zwei 35 mm Petrischalen zur Hälfte mit Ringer-Lösung. </li><li> Sacrifice das Tier unter dim rotes Licht und entfernen Sie die Augen. Anschließend werden sämtliche Verfahren unter Infrarot-Licht mit einem Binokular oder eine Kamera mit einem Video-Monitor durchgeführt. </li><li> Entfernen Sie alle übrig gebliebenen Gewebe aus der äußeren Oberfläche des Auges. Cut und entfernen Sie den vorderen Teil, dann übertragen Sie die Augenmuschel in eine der Petrischalen mit Ringerlösung gefüllt. </li><li> Entfernen Sie den Glaskörper und sorgfältig trennen die Netzhaut aus dem Rest der Augenmuschel durch Abklemmen oder Schneiden aller Anhänge. Heben Sie die Netzhaut und trennen sie vollständig von der Augenmuschel. </li><li> Übertragung der Netzhaut auf die zweite Petrischale mit einer Kunststoff-Transferpipette. Halten Sie die Schale mit der Netzhaut in einem lichtdichten Kasten. </li></ol> 4. Isolierung einzelner Sehzellen <ol><li> Alle Verfahren werden unter Infrarot-Licht durchgeführt. Schneiden Sie ein kleines Stück Netzhaut und übertragen Sie es mit einem Kunststoff-Pipette auf eine Sylgard-Schale mit Deckel. Das Volumen der Lösung, welche die Netzhaut Stück sollte etwa 250 ul werden. </li><li> Schnappen Sie sich ein kleines Stück Rasierklinge mit dem Messerhalter - der Rand des Blattes sollte bei ca. 45 °-Winkel an den Inhaber sein. Glätten Sie das Stück auf der Netzhaut Sylgard Schicht und mit dem Messer schneiden das Stück Netzhaut fein, während man selbst auf die Sylgard Schicht geklebt. </li><li> Transfer-200 ul der Lösung, die die Zellen zu einer experimentellen Kammer - lassen Sie alle verbleibenden Stück der Netzhaut in der Sylgard-Schale mit Deckel. Halten Sie die Kammer mit dem isolierten Zellen in einem lichtdichten Kasten. </li><li> Warten Sie 10 min für die Zellen zu regeln, dann fügen Sie 2-3 ml Ringer. In diesem Stadium können die isolierten Zellen mit einem bestimmten Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Fura-2) nach dem Farbstoff loading-Protokoll geladen werden. </li><li> Die Zellen können nun mit dem Mikroskop Bühne für Experimente gemacht werden. </li></ol> 5. Fluoreszenz-Imaging <ol><li> Übertragen Sie die Kammer auf der Bühne des Epifluoreszenzmikroskop. Passen Lösung Perfusion, Temperaturfühler, Infrarot-Beleuchtung, etc. </li><li> Schließen Sie die Vorhänge und beginnen zu experimentieren. Schalten Sie das Infrarot-Licht im Innern des Mikroskops Käfig auf dem Boden der experimentellen Kammer zu konzentrieren, und bewegen Sie die Bühne auf der Suche nach Zellen. </li></ol> 6. Repräsentatives Ergebniss: Abb.. 1 zeigt die Morphologie der gesunden isoliert lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen mit diesem Protokoll aus einem Salamander (Ambystoma tigrinum) Retina erhalten. Salamander-Zellen wurden ausgiebig für einzelne Zelle Fluoreszenz-Imaging-Studien wegen ihrer Größe und ihrer Fähigkeit, für mehrere Stunden nach der Isolierung von der Netzhaut überleben verwendet. Darüber hinaus von einem Salamander Netzhaut kann man regelmäßig erhalten sowohl lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen. Ein wichtiges Kriterium für die Gesundheit der Zellen ist das Vorhandensein einer intakten Ellipsoid (Abb. 1), die Teil der Zelle, wo die Mitochondrien konzentriert sind. Wenn die Zellen unter DAPI Optik betrachtet, gibt dieser Konzentration der Mitochondrien eine starke Fluoreszenz-Signal (Abb. 2) durch die Anwesenheit von NADH. Der Mangel an einer intakten Ellipsoid ist ein Zeichen für eine beschädigte Zelle, in der Regel ungeeignet für den Versuch. Abb.. 3 zeigt eine beschädigte Salamander Stange Photorezeptor, mit einem geschwollenen Zellkörper und einer kondensierten Kern. Solche Zellen zeigen eine deutlich geringere Fluoreszenz unter DAPI Optik, sondern betrachtet unter FITC Optik zeigen eine starke FAD-Signal in das Ellipsoid Region (aus oxidiertem Flavin Nukleotiden und Flavoproteinen). Ein weiteres Kriterium für die Gesundheit der isolierten Photorezeptoren ist ihre Fähigkeit, all-trans-Retinol (Vitamin A) in ihrer äußeren Segmente nach Stimulation durch Licht zu erzeugen. Die Erzeugung von Vitamin A erfordert erhebliche Mengen an NADPH, die auf eine intakte metabolische Maschinerie abhängt. Abbildungen 4 und 5 zeigen die Bildung von Vitamin A in der äußeren Segmente der intakten Frosch und Maus Stäbchen-Photorezeptoren bzw.. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Gesunde einzelnen lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen. Die Zellen wurden aus einem Tiger Salamander Netzhaut isoliert. Phototransduktion findet im äußeren Segment und das Ellipsoid ist dicht mit Mitochondrien verpackt. Stäbchen sind für das schwache Licht Vision, Kegel für helles Licht Vision. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Fluoreszenz lebender Salamander Stäbchen und Zapfen. Diese sind dunkel-adaptierten Zellen, zeigen starke NADH Fluoreszenz in ihren jeweiligen Ellipsoide und keine signifikanten Vitamin-A-Fluoreszenz in ihrer äußeren Segmente. Die Erfassung der Fluoreszenz-Bild repräsentiert die erste Belichtung mit sichtbarem Licht nach dem Zeitraum von dark-Anpassung. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Beschädigte Salamander Stange Photorezeptor. Der geschwollene Zellkörper und die verkürzte Kern sind bezeichnend für Schäden. Die Zelle wird oxidiert und es ist minimal NADH-Signal (DAPI-Optik), aber viel stärker FAD-Signal (FITC Optik). <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Frog Stab mit NADH und Retinol. Dies ist ein gesunder Frosch Stange Photorezeptor ein starkes NADH Fluoreszenz im Ellipsoid Region. Vor Lichteinwirkung eine minimale Fluoreszenz in das äußere Segment. Nach Belichtung gibt es einen deutlichen Anstieg in das äußere Segment Fluoreszenz durch die Bildung von Vitamin A. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Maus Stab mit Retinol. Dies ist eine gesunde Maus Stange Photorezeptor zeigt signifikante äußere Segment Fluoreszenz nach der Belichtung durch die Bildung von Vitamin A. Das Ellipsoid Regionen von Maus-Stäbchen-Photorezeptoren nicht zeigen eine starke Fluoreszenz-Signal.

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K., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+Microfluorometric+Studies+of+Reduction+and+Clearance+of+Retinal+in+Bleached+Rod+Photoreceptors.">Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).</li><li>Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. 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R., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+All-Trans+Retinol+after+Visual+Pigment+Bleaching+in+Mouse+Photoreceptors.">Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).</li></ol>

Wenn gesunde isolierten Zellen nicht erhalten werden, liegt das Problem entweder mit der Isolierung oder der Gesundheit der Netzhaut oder mit ihren Hacken. In der Regel nach dem Entfernen der Vorderseite des Auges und der Glaskörper, die Netzhaut leicht hebt das Pigmentepithel. Wenn es nicht zu schälen versuchen Sie ausgehend von der Peripherie der Augenmuschel. Wenn es immer noch schwer zu trennen, ist eine wahrscheinliche Möglichkeit, dass das Tier wurde nicht dunkel-adaptierten für eine angemessene Zeit, oder das...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Dunklen Raum (100-150 m 2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rote Ampeln 19 </td><td></td><td></td><td> Online-Shops </td></tr><tr><td> Infrarot-Lichtquellen und Infrarot-Bildbetrachter </td><td> FJW Optical Systems, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Präpariermikroskop 19 </td><td></td><td></td><td> Ausgestattet mit Infrarot-Zuschauer </td></tr><tr><td> Epifluoreszenzmikroskop in einem lichtdichten Käfig 19 umschlossen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissecting Werkzeuge (Scheren, Pinzetten, Messerhalter) </td><td> Roboz oder Fine Science Tools </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard Elastomer </td><td> Essex (Charlotte, NC) </td><td> Sylgard 184 Elastomer-Kit </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Ornithin (0,01%) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin (0,1%) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920 </td><td> Verdünnen auf 0,01% </td></tr><tr><td> Experimentelle Kammern </td><td> Warner Instruments (Hamden, CT) </td><td> D3512P </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen, Kunststoffpipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of living isolated vertebrate photoreceptor cells for fluorescence imaging

In der Retina ist Phototransduktion, die Umwandlung von Licht in ein elektrisches Signal, durch die Stäbchen und Zapfen Sehzellen 1-4 durchgeführt. Stäbchen-Photorezeptoren sind für das Sehen zuständig bei schwachem Licht, Kegel in helles Licht. Phototransduktion erfolgt in den äußeren Teil der Sehzellen, ein spezialisiertes Fach, dass eine hohe Konzentration von visuellen Pigment, das primäre Lichtdetektor enthält. Cis-Retinal, die an ein Protein, Opsin - Die visuelle Pigment besteht aus einem Chromophor, 11 zusammengesetzt. Ein Photon durch die visuelle Pigment absorbiert isomerisiert des Chromophors von 11 - cis zu all-trans. Diese Photoisomerisierung führt zu einer Konformationsänderung in die visuelle Pigment, das eine Kaskade von Reaktionen gipfelte in einer Änderung des Membranpotentials, und die Herbeiführung einer Transduktion der Lichtreiz in ein elektrisches Signal auslöst. Die Erholung der Zelle aus Licht Stimulation beinhaltet die Deaktivierung der Zwischenprodukte durch Licht aktiviert, und die Wiederherstellung des Membranpotentials. Ca 2 + moduliert die Aktivität von mehreren der Enzyme in Phototransduktion beteiligt, und seine Konzentration auf Licht Stimulation reduziert. Auf diese Weise Ca 2 + spielt eine wichtige Rolle in der Erholung der Zelle aus Licht Stimulation und seine Anpassung an Hintergrundlicht. Ein weiterer wesentlicher Bestandteil der Recovery-Prozess ist die Regeneration der visuellen Pigment, während Licht-Erkennung wurde durch die Photoisomerisierung von seinen 11 zerstört - cis Chromophor all-trans 5-7. Diese Regeneration beginnt mit der Veröffentlichung von all-trans Retinal durch die photoaktivierte Pigment, hinterlässt der Apo-Protein Opsin. Die freigesetzten all-trans-Retinal wird schnell in eine Reaktion unter Verwendung von NADPH zu all-trans-Retinol und Opsin reduziert kombiniert mit frischen 11 - cis-Retinal in die äußere Segment der Sehpigment Reform gebracht. All-trans-Retinol wird dann aus dem äußeren Bereich und in den benachbarten Zellen, die durch den spezialisierten Träger Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein (IRBP) übertragen. Fluoreszenz-Imaging von einzelnen Sehzellen kann verwendet werden, um ihre Physiologie und Zellbiologie studieren. Ca 2 +-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen kann verwendet werden, um im Detail zu untersuchen das Zusammenspiel zwischen äußeren Segment Ca 2 + Veränderungen und Antwort zu 8-12 sowie die Rolle der inneren Segment Ca 2 + Läden in Ca 2 +-Homöostase Licht 13,14 . Fluoreszierende Farbstoffe können auch zur Messung von Mg 2 +-Konzentration verwendet werden 15, pH-Wert und als Tracer von wässrigen und Membran Fächer 16. Schließlich kann die Eigenfluoreszenz von all-trans-Retinol (Vitamin A) verwendet werden, um die Kinetik der Bildung und Entfernung in einzelnen Sehzellen 17-19 überwachen.

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Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

Eine Methode ist für die Herstellung von einzelnen lebenden Sehzellen aus verschiedenen Wirbeltierarten für Fluoreszenz-Bildgebung beschrieben. Die Methode kann zur Abbildung der Fluoreszenz von endogenen Fluorophore wie NADH oder Vitamin A, oder dass von exogen zugesetztem Fluoreszenzfarbstoffen empfindlich gegen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Oder anderen Faktoren.

Vorbereitung der Lebens-Isolated Vertebrate Sehzellen für Fluoreszenz-Imaging

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K Aufrufe.  Medical University of South Carolina. Eine Methode ist für die Herstellung von einzelnen lebenden Sehzellen aus verschiedenen Wirbeltierarten für Fluoreszenz-Bildgebung beschrieben. Die Methode kann zur Abbildung der Fluoreszenz von endogenen Fluorophore wie NADH oder Vitamin A, oder dass von exogen zugesetztem Fluoreszenzfarbstoffen empfindlich gegen Ca 2 + Oder anderen Faktoren.

Serie: Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratom Schnitte Maus-Retina zu Photorezeptor Kulturen vorbereiten

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Assay-Entwicklung für hohe Content Quantifizierung der Sod1 mutierten Proteins Aggregatbildung in lebenden Zellen

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often rodents. This approach limits the interrogation of blood-brain barrier (BBB) properties to the cortex and does not allow for individual comparison. This project focuses on the development of an isolation method that allows for the comparison of the neurovascular unit (NVU) from multiple CNS regions: cortex, cerebellum, optic lobe, hypothalamus, pituitary, brainstem, and spinal cord. Moreover, this protocol, originally developed for murine samples, was successfully adapted for use on CNS tissues from small and large vertebrate species from which we are also able to isolate microvessels from brain hemisphere white matter. This method, when paired with immunolabeling, allows for quantitation of protein expression and statistical comparison between individuals, tissue type, or treatment. We proved this applicability by evaluating changes in protein expression during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of a neuroinflammatory disease, multiple sclerosis. Additionally, microvessels isolated by this method could be used for downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot, among others. Even though this is not the first attempt to isolate CNS microvessels without the use of ultracentrifugation or enzymatic dissociation, it is unique in its adeptness for the comparison of single individuals and multiple CNS regions. Therefore, it allows for investigation of a range of differences that may otherwise remain obscure: CNS portions (cortex, cerebellum, optic lobe, brainstem, hypothalamus, pituitary, and spinal cord), CNS tissue type (gray or white matter), individuals, experimental treatment groups, and species.

The goal of this protocol is to isolate microvessels from multiple regions of the central nervous system of lissencephalic and gyrencephalic vertebrates.

Zuverlässige Isolierung von Mikrogefäßen des zentralen Nervensystems über fünf Wirbeltiergruppen hinweg

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks of Parkinson's disease. Yet, much of its biological activity, as well as its aggregation, centrally involves the soluble monomer form of the protein. Elucidation of the molecular mechanisms of aSyn biology and pathophysiology requires structurally highly resolved methods and is sensitive to biological conditions. Its natively unfolded, meta-stable structures make monomeric aSyn intractable to many structural biology techniques. Here, the application of one such approach is described: hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry (HDX-MS) on the millisecond timescale for the study of proteins with low thermodynamic stability and weak protection factors, such as aSyn. At the millisecond timescale, HDX-MS data contain information on the solvent accessibility and hydrogen-bonded structure of aSyn, which are lost at longer labeling times, ultimately yielding structural resolution up to the amino acid level. Therefore, HDX-MS can provide information at high structural and temporal resolutions on conformational dynamics and thermodynamics, intra- and inter-molecular interactions, and the structural impact of mutations or alterations to environmental conditions. While broadly applicable, it is demonstrated how to acquire, analyze, and interpret millisecond HDX-MS measurements in monomeric aSyn.

The structural ensemble of monomeric alpha-synuclein affects its physiological function and physicochemical properties. The present protocol describes how to perform millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry and subsequent data analyses to determine conformational information on the monomer of this intrinsically disordered protein under physiological conditions.

Millisekunden-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Untersuchung der Alpha-Synuclein-Strukturdynamik unter physiologischen Bedingungen

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...