Wir erkennen die USF Durchflusszytometrie Core Facility. Wir möchten Dr. Denise Cooper für den Austausch von Ressourcen zu danken. Wir möchten auch Maya Cohen, Laura Pendleton und Diana Latour für ihre Unterstützung danken, bei der Einrichtung und der Dreharbeiten zu diesem Film. NN von der NSF FG-LSAMP Brücke zur Promotion Fellowship HRD # 0929435 unterstützt. Diese Arbeit wurde von der American Cancer Society Institutional Research Grant # 93-032-13/Moffitt Cancer Center ausgezeichnet zu TG finanziert.

Vor dem Start, bereiten Sie die folgenden Lösungen: 3% Färbung Media (SM): -3% Fötalem Rinderserum (FBS) in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) MACS-Puffer (MB): - 0,5% Albumin aus Rinderserum (BSA) in 1XPBS 1. Ernte Milz von Mäusen <ol><li> Subkutan injizieren 6-8 Wochen im Alter von C57BL / 6 Mäuse (Harlan) mit 1,5 x 10 5 Panc02 murinen Zellen in 100 ul 1x PBS suspendiert (tumortragenden; TB). Kontrollmäusen (Naive) erhalten 100 ul 1XPBS. </li><li> Etwa 4 Wochen nach der Injektion, einschläfern Mäusen durch Kohlendioxid erstickend wirken. </li><li> Ernte Milz von Mäusen durch stumpfe Dissektion mit einer Pinzette und Schere dann wiegen mit einer Waage. Ort Milz in separaten, etikettiert 50 ml konischen Röhrchen mit 1 x PBS. </li></ol> 2. Generieren Sie ein Einzel-Zell-Federgabeln von Leukozyten aus Milz Alle Verfahren sollten in einer sterilen Umgebung unter einem Biologische Sicherheit Hood und Zellen und Antikörper auf Eis gehalten durchgeführt werden. <ol><li> Montieren Zellabtrennungssiebes durch Einsetzen des Mesh-Sieb in die Öffnung des Bechers nach unten. Dann legen Sie den Sicherungsring in das Gewinde mit der geschlitzten Seite nach oben und mit dem Ring-Taste, um den Haltering ziehen und hält so den Bildschirm an Ort und Stelle. Setzen Sie den montierten Sieb in eine Petrischale mit 10 ml 1 x PBS. </li><li> Pool Milz und Formate Glas Pistill zu Milz gegen die Mesh-Sieb des Zellabtrennungssiebes und in die Petrischale zu schleifen. Wiederholen für jede Behandlung von Mäusen. </li><li> Filter Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen mit einer 70 um Zellsieb und eine 5 ml serologische Pipette. Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min. </li><li> Überstand abnehmen und Pellet in 5 ml 1 x RBC Lysispuffer pro Milz. Jeweils oben und unten kräftig. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Die Reaktion durch Zugabe von 20 ml 1 x PBS. Jeweils oben und unten kräftig. Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min. </li><li> Überstand abnehmen und Pellet in 20 ml sterilem 1 x PBS. Jeweils oben und unten kräftig. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung von Trypanblau und eines Hämozytometers und resuspendieren in gewünschten Konzentration in 3%, so dass SM 50 ul entspricht 5x10 5-1x10 6 Zellen (1x10 7 Zellen / ml - 2x10 7 Zellen / ml). </li></ol> 3. Zelloberflächen-Bemalen / Immunphänotypisierung von MDSC mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Beschriften Sie die Vertiefungen einer 96-Well-V Bodenplatte für die Steuerung und experimentellen Proben und einzelne Flecken auf Ersatz Kontrollen (keine Flecken, NS, Mac-1-FITC; Gr-1-APC und DAPI). </li><li> In 5x10 5-1x10 6 Zellen in Höhe von 50 ul / Vertiefung von Splenozyten ihren jeweiligen Vertiefungen in der 96-Well-V-Bodenplatte. ZentrifugierenPlatte bei 12.000 rpm (250-300 × g) für 5 min. </li><li> Bereiten Sie &quot;Master Mix&quot; (MM) der Maus BD FC-Baustein (Ratte anti-Maus-CD16/32 monoklonaler Antikörper) in 3% SM verdünnt, in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Als Ausgangspunkt verwenden 1 pg FC-Baustein in 3% SM für ein Endvolumen von 50 ul, pro Vertiefung. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand aus jeder Vertiefung der 96-Loch-V-Bodenplatte durch schnelles Umdrehen der Platte über und zurück, über einen Abfallbehälter oder ein Waschbecken ohne Störung der Zell-Pellets. </li><li> Vortex, kurz zentrifugieren FC-Baustein MM für 5 Sekunden und 50 ul zu allen Pellets im 96-Well-V-Bodenplatte. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren, so dass Proben in ihre Brunnen. Inkubieren Platte für 15 min im Dunkeln auf Eis. Zentrifugenplatte bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min. </li><li> Bereiten Sie &quot;Master Mix&quot; (MM) von Fluorochrom-konjugierte Antikörper in 3% SM in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis verdünnt, während Proben mit FC-Baustein inkubieren. Antikörper sollten titriert werdenum optimale Verdünnung für Färbeverfahren zu bestimmen. Als Ausgangspunkt, kombinieren eine Verdünnung von 1.25 Mac-1-FITC und 1:20 Verdünnung von Gr-1-APC in 3% SM für ein Endvolumen von 50 ul, pro Probe gut. </li><li> Vorsichtig Überstand zu entfernen aus jeder Vertiefung der 96-Well-V-Boden, wie zuvor beschrieben. </li><li> Vortex, kurz zentrifugieren MM von fluoreszierenden-konjugierte Antikörper-Färbung für 5 Sekunden und 50 ul, die Kontrolle und experimentelle Pellets. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Für Single-Fleck Kompensationen, fügen Sie eine Verdünnung von 1.25 Mac-1-FITC, 1:20 Verdünnung von Gr-1-APC und 75 ng / ml DAPI, in 3% SM für ein Endvolumen von 50 ul pro Well an ihre jeweiligen Brunnen. Dann werden 50 ul 3% auf gut SM ungefärbt (keine Flecken). Gut mischen und inkubieren Zellen in 96-Well-V-Bodenplatte für 30 min im Dunkeln auf Eis. </li><li> Label-FACS-Röhrchen (5 ml, 12 mm x 75 mm Polystyrol Rundbodengefäße) zu jeder Vertiefung in der 96-Well-V-Bodenplatte entsprechen. Geben Sie 200 ul 3% SM zu jedem FACSRohr. </li><li> Zentrifugenplatte bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min und Überstände entfernen. Waschen Sie Pellets durch Zugabe von 100 ul 3% SM zu jedem Pellet und mischen Sie gut durch leichtes Auf-und Abpipettieren. Zentrifugenplatte bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min. Wiederholen Sie Schritt noch einmal zu waschen. </li><li> Vorsichtig Überstand zu entfernen aus jeder Vertiefung der 96-Well-V-Boden, wie zuvor beschrieben. Resuspendieren jedes Pellet in 100 ul 3% SM und gut mischen. </li><li> Übertragen Sie 100 ul resuspendierten Pellets aus jedem Well der 96-Loch-V-Bodenplatte, um ihre jeweils beschriftet FACS-Röhrchen. </li><li> Vor-Zytometrie-Analyse fließen, fügen 75 ng / ml DAPI zu steuern und zu experimentellen Proben und DAPI einzigen Fleck-Kompensation. </li><li> Führen Sie die durchflusszytometrische Erfassung von MDSC Prozentsätze. Führen Ausgleich mit dem negativen (keine Flecken Kontrolle) und die einzige positive Kontrollen. Richten Sie eine Dot-Plot, der die nach vorn (FSC) gegen seitliche Streulicht (SSC) in Log-Skala zeigt, so dass Leukozyten-Populationen vonInteresse identifiziert werden kann. Zeichnen Sie ein großes Tor auf allen Leukozyten, ohne Schmutz und Klümpchen mit niedrigsten Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht. Von diesem übergeordneten Tor, erstellen Sie einen neuen Dot-Plot, der SSC gegen DAPI und Tor zeigt auf DAPI-(Live-) Zellen. Wählen Sie diese neu gated Bevölkerung und schaffen eine Dot-Plot, der Mac-1 gegen Gr-1 und Tor zeigt auf Ihrem doppelt positiven (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC. </li></ol> 4. Magnetischen Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten <ol><li> Aliquotieren 1x10 7 verbleibenden ungefärbten Leukozyten in entsprechend beschriftete FACS-Röhrchen und zentrifugieren bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min. </li><li> Planen MM von Gr-1-PE-Antikörper in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für bis zu 10 7 Zellen, verwenden Sie eine 1:10 Verdünnung von Gr-1-PE-Antikörper in 50 l MB, pro Probe. Für größere Zellzahlen, bis Volumina entsprechend zu skalieren. Kurz für 5 Sekunden zentrifugiert, in den Leukozyten in FACS-Röhrchen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li&gt; <li> 2 ml MB auf FACS-Röhrchen, Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min und Überstand verwerfen. </li><li> Bereiten MM von Anti-PE MicroBeads in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für bis zu 10 7 Zellen, verwenden Sie ein 1:4-Verdünnung des Anti-PE MicroBeads in 200 ul MB, pro Probe. Für größere Zellzahlen, bis Volumina entsprechend zu skalieren. Kurz für 5 Sekunden zentrifugiert, in den Leukozyten in FACS-Röhrchen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> 2 ml MB auf FACS-Röhrchen, Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min und Überstand verwerfen. Pellet in 3 ml SB. Anschließend wird durch ein 70 um Sieb in eine neue, markierte 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Vorbereiten und grundieren Auto MACS Separator Pro. Refill alle Flaschen mit den entsprechenden Lösungen und leeren die Abfallbehälter, falls erforderlich. Gerät einschalten und prüfen Status der Flüssigkeitsbehälter und Spalte (n) nach der Initialisierung. Alle Symbole sollte grün leuchten. Auf dem Menü wählen Sie &quot;Trennung&quot; von der oberenMenüleiste gefolgt von &quot;Jetzt waschen&quot; aus der unteren Menüleiste. Wählen Sie &quot;Spülen&quot; aus dem Pop-up-Option von &quot;Run&quot;, um die Grundierung zu starten gefolgt. Sobald die Grundierung Prozess erfolgreich abgeschlossen ist, wird das Instrument zeigt dann, dass es &quot;Ready for Separation&quot; unter dem Status-Menü. </li><li> Wählen Sie die passende gekühlt Tube-Rack für Rohrdurchmesser und Platz 50 ml konischen Röhrchen mit magnetisch markierte Zellen in Reihe A, 50 ml konischen Röhrchen für die negative Fraktion Sammlung in Zeile B und 15 ml konischen Röhrchen für die positive Fraktion Sammlung in der Reihe C </li><li> Wählen Sie &quot;POSSEL_S&quot; Zellseparation Programm für die positive Selektion von markierten Zielzellen in sensiblen Modus von Proben. Die magnetisch markierte Zielzellen auf der Säule zurückgehalten Automaten; unmarkierten Zellen in der negativen Fraktion Sammelrohr in der Zeile B. über automatisierte Zurückziehen des Magneten losgelassen wird, die markierten Zielzellen, in die positive Sammelrohr in Reihe C des Rohrs freigegeben Rack. </li></ol>+ Enriched Leukozyten <ol><li> Recount Gr-1 + und Gr-1 - Fraktionen unter Verwendung von Trypanblau und eine Hämazytometer. Die Zellen in der gewünschten Konzentration in 3% Färbung Medium, so daß 50 ul entspricht 5x10 5-1x10 6 Zellen (1x10 7 Zellen / ml - 2x10 7 Zellen / ml) zugefügt und 50 ul entsprechend markierten FACS-Röhrchen. </li><li> Vorbereiten einer MM von Mac-1 nur bei 1:25 Verdünnung in 3% SM auf ein Endvolumen von 50 ul pro Probe. Stain Zellen und bereiten einzigen Fleck Kompensationen von Gr-PE, Mac-1 FITC und DAPI für die Durchflusszytometrie-Analyse. Geben Sie 200 ul 3% SM und DAPI Lebensfähigkeit Farbstoff wie zuvor beschrieben. </li><li> Führen durchflusszytometrische Datenerfassung bis Gr-1 + und Gr-1 zu bestimmen - und Prozentsätze zu vergleiche auch MDSC Prozentsätze Pre-und Post-autoMACS Bereicherung. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Hier zeigen wir r<html> epräsentativer Ergebnisse für autoMACS Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten aus gepoolten, naiv Milz für die anschließende FACS-Sortierung von MDSC (Abbildung 1). 1x10 6 naiv Leukozyten wurden mit Mac-1-FITC und Gr-1-APC-Antikörpern gefärbt, um MDSC Prozentsätze mit einem BD LSRII Instrument zu identifizieren, vor autoMACS Sortierung. 1x10 7 naiven Leukozyten wurden dann mit Anti-Gr-1-PE und PE-Antikörper MicroBeads zur Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten unter Verwendung eines autoMACS Pro Separator gefärbt. Post-autoMACS Bereicherung, Gr-1 Prozentsätze in Gr-1 + und Gr-1 - gesammelten Fraktionen wurden mittels Durchflusszytometrie. 1x10 6 Gr-1 + Leukozyten wurden entfernt und mit Mac-1-FITC-Antikörper zu analysieren und zu vergleichen, MDSC Prozentsätze von angereichertem, vereinigt naiven Leukozyten an nicht-angereicherten, Tumor-tragenden vereinigt Leukozyten mittels Durchflußzytometrie gefärbt. fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. AutoMACS Anreicherung von Naive Gr-1 + Leukozyten für MDSC FACS-Sorting. Die Milz wurde von Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen und naiv geerntet und verarbeitet in den Single-Zellsuspensionen. Durchflusszytometrie-Analyse von naiven Leukozyten Oberfläche mit Mac-1 und Gr-1 Fluoreszenz-konjugierte Antikörper gefärbt, vor autoMACS Bereicherung (A). Durchflusszytometrie-Analyse von Gr-1 + (B) und Gr-1 - (C) Fraktionen post-autoMACS Anreicherung von Gr-1 + Zellen aus gepoolten naiv leuckocytes mit Gr-1-PE-Antikörper und anti-PE MicroBeads gefärbt. Durchflusszytometrie-Analyse der MDSC und Gr-1 + Prozentsätze nach autoMACS Anreicherung von Gr-1 +-Zellen aus naiven vereinigt Leukozyten (D) im Vergleich zu nicht-angereicherte vereinigt Leukozyten aus Tumor-tragenden Mäusen (E) (naive Mäuse, n = 5 , Tumor-tragenden Mäusen, n = 3). MDSC und Gr-1 Prozentsätze sind gated in den repräsentativen Konturdiagramme und Histogramme.

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	<li>Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+during+acute+Trypanosoma+cruzi+infection:+involvement+of+Ly6G+(Gr1(+))CD11b(+)+immature+myeloid+suppressor+cells.">Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells.</a> Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).</li><li>Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD11b+Ly-6C(hi)+suppressive+monocytes+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).</li><li>Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD11b+/Gr-1++myeloid+suppressor+cells+cause+T+cell+dysfunction+after+traumatic+stress.">CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress.</a> J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).</li><li>Ghansah, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+myeloid+suppressor+cells+in+SHIP-deficient+mice+represses+allogeneic+T+cell+responses.">Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses.</a> J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).</li><li>Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+SHIP+deficiency+expands+myeloid+regulatory+cells+and+abrogates+graft-versus-host+disease.">Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease.</a> J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).</li><li>Yin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+prevent+type+1+diabetes+in+murine+models.">Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models.</a> J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).</li><li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system.">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).</li><li>Gallina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8++T+cells.">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).</li><li>Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+frequency+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+mice+with+spontaneous+pancreatic+carcinoma.">Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma.</a> Immunology. 128, 141-149 (2009).</li><li>Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+derived+suppressor+cells+in+human+diseases.">Myeloid derived suppressor cells in human diseases.</a> Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).</li><li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).</li><li>Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets,+expansion+and+activation+of+myeloid-derived+suppressor+cells.">Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells.</a> Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).</li><li>Pilon-Thomas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Pancreatic+Adenocarcinoma+Dampens+SHIP-1+Expression+and+Alters+MDSC+Homeostasis+and+Function.">Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Panopoulos, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+governs+distinct+pathways+in+emergency+granulopoiesis+and+mature+neutrophils.">STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils.</a> Blood. 108, 3682-3690 (2006).</li><li>Preynat-Seauve, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extralymphatic+tumors+prepare+draining+lymph+nodes+to+invasion+via+a+T-cell+cross-tolerance+process.">Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process.</a> Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).</li><li>Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separations+by+flow+cytometry.">Cell separations by flow cytometry.</a> Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).</li><li>Maecker, H., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+reagents+for+multicolor+BD+flow+cytometry.">Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry.</a> Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).</li><li>Bagwell, C. B., Adams, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Spectral+Overlap+Compensation+for+Any+Number+of+Flow+Cytometry+Parameters.">Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).</li><li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li><li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+magnetic+techniques+for+the+isolation+of+cells.">Use of magnetic techniques for the isolation of cells.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).</li><li>Collazo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHIP+limits+immunoregulatory+capacity+in+the+T-cell+compartment.">SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment.</a> Blood. 113, 2934-2944 (2009).</li><li>Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+yield+from+small+cell+populations+sorted+by+flow+cytometry+applying+different+isolation+procedures.">Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures.</a> Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).</li><li>Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+responses+of+human+regulatory+T+cells+(Treg)+and+effector+T+cells+to+rapamycin.">Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin.</a> PLoS One. 4, e5994 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dies ist eine detaillierte Verfahren zum Verarbeiten und immunophentyping MDSC Populationen, die für verschiedenen lymphoiden Geweben von verschiedenen Tiermodellen ist. Insbesondere kann autoMACS Anreicherung für die Isolierung von verschiedenen Leukozytenpopulationen einschließlich Gr-1 Depletion von Splenozyten 4, Reinigung von myeloiden Teilmengen aus Milzzellen und Lymphknoten 5, Isolierung von Knochenmark Neutrophilen 14 und Reinigung von CD8 + T-Zellen aus der Milz v...

<table border="1"><tbody><tr><td> REAGENZ </td><td> UNTERNEHMEN </td><td> Katalog # </td><td> KOMMENTARE </td></tr><tr><td> 1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SH30028.02 </td><td> Ca 2 + / Mg 2 + / Phenolrot-freiem </td></tr><tr><td> Albumin aus Rinderserum (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Lassen Sie ungestört auflösen BSA in PBS; sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SV3001403HI </td><td> Hitze inaktiviert; sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Ratte anti-Maus-CD16/32 monoklonalen Antikörper (Fc-Block) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD11b (Mac-1) FITC </td><td> eBiosciences </td><td> 11-0112 </td><td> SterilUmwelt </td></tr><tr><td> Anti-Maus Ly6G (Gr-1) APC </td><td> eBiosciences </td><td> 17-5931 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Anti-Maus Ly6G (Gr-1) PE </td><td> eBiosciences </td><td> 12-5931 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td><td> Verdünnungsreihe sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Zellabtrennungssiebes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CD1-1KT </td><td> Autoklav vor der Verwendung </td></tr><tr><td> Um 70-Sieb </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> 1X RBC Lysis Buffer </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td> Warm auf Raumtemperatur vor Gebrauch; sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Petrischalen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-12 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> 50ml coniCal-Rohre </td><td> Thermo Scientific </td><td> 339652 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> 5ml 12X75mm Polystyrol Röhrchen mit rundem Boden </td><td> BD Biosciences </td><td> 352054 </td><td> Bekannt als FACS-Röhrchen, sterile Umgebung </td></tr><tr><td> 96-Well-Platten mit V-Boden </td><td> Corning </td><td> 3897 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Cellgro </td><td> 25-900-CI </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> PE MicroBeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-048-801 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> AutoMACS Pro Separator </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS Spalten </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-021-101 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS Laufpuffer </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-221 </td><td&gt; </td></tr></tbody></table>

preparation of myeloid derived suppressor cells (mdsc) from naive and pancreatic tumor-bearing mice using flow cytometry and automated magnetic activated cell sorting (automacs)

MDSC sind eine heterogene Population von unreifen Makrophagen, dendritischen Zellen und Granulozyten, die in lymphatischen Organen bei pathologischen Zuständen einschließlich parasitäre Infektionen, Entzündungen, traumatischen Stress, Graft-versus-host-Krankheit, Diabetes und Krebs 7.1 ansammeln. Bei Mäusen, MDSC ausdrückliche Mac-1 (CD11b) und Gr-1 (Ly6G und Ly6C) Oberflächenantigene 7. Es ist wichtig zu beachten, dass MDSC auch in verschiedenen Tumor-tragenden Hosts, wo sie deutlich erweitert werden untersucht und zu unterdrücken Anti-Tumor-Immunantwort gegenüber naiven Kollegen 7-10. In Abhängigkeit von den pathologischen Zustand, gibt es verschiedene Subpopulationen von MDSC mit unterschiedlichen Mechanismen und Ziele der Unterdrückung 11,12. Daher sind wirksame Mittel zur lebensfähigen MDSC Populationen zu isolieren, die Aufklärung ihrer verschiedenen molekularen Mechanismen der Unterdrückung in vitro und in vivo. Vor kurzem hat die Ghansah Gruppe hat den Ausbau MDSC in einem murinen Pankreaskarzinom-Modell berichtet. Unsere tumortragenden MDSC zeigen ein Verlust der Homöostase und erhöht suppressive Funktion im Vergleich zu naiven MDSC 13. MDSC Prozentangaben sind deutlich weniger in lymphoiden Kompartimente von naiven vs Tumor-tragenden Mäusen. Dies ist eine große Einschränkung, die oft behindert genaue vergleichende Untersuchungen dieser MDSC. Deshalb bereichern Gr-1 + Leukozyten aus naiven Mäusen vor Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) erhöht Reinheit, Viabilität und reduziert Art Zeit. Allerdings ist die Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten aus tumortragenden Mäusen optional, da diese in Hülle und Fülle für die schnelle FACS-Sortierung sind. Daher wird in diesem Protokoll beschreiben wir eine hocheffiziente Methode der Immunphänotypisierung MDSC und bereichernde Gr-1 + Leukozyten aus Milzen von naiven Mäusen für die Sortierung MDSC in einer fristgerechten Weise. Immunkompetenten C57BL / 6 Mäusen mit murinem Panc02 ce inokuliertlls subkutan während naive Mäuse erhalten 1XPBS. Etwa 30 Tage nach der Inokulation, Milzen entnommen und in den Single-Zellsuspensionen mit einem Zellabtrennungssiebes verarbeitet. Milzzellen werden dann Rote Blutkörperchen (RBC) lysiert und ein Aliquot dieser Leukozyten angefärbt mit Fluorochrom-konjugierten Antikörper gegen Mac-1 und Gr-1 zu Immunphänotyp MDSC Prozentsätze mittels Durchflusszytometrie. In einem parallelen Experiment, werden ganze Leukozyten aus naiven Mäusen mit fluoreszierenden konjugierten Gr-1-Antikörper, mit PE-Microbeads inkubiert und positiv selektiert mit Hilfe eines automatisierten Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator gefärbt. Als nächstes wird ein Aliquot der Gr-1 + Leukozyten mit Mac-1-Antikörper gefärbt, um die Erhöhung der MDSC Prozentwert mit Durchflusszytometrie zu identifizieren. Nun sind diese Gr1 + angereicherten Leukozyten bereit für FACS-Sortierung von MDSC in vergleichenden Analysen verwendet werden (naiv vs tumortragenden) in in vivo und in vitro </em&gt;-Assays.

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Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

Dies ist eine schnelle und umfassende Methode der Immunphänotypisierung Myeloide Suppressorzellen (MDSC) und bereichernde Gr-1<sup&gt; +</sup&gt; Leukozyten aus Maus-Milz. Diese Methode verwendet Durchflusszytometrie und autoMACS Zellsortier für tragfähige Gr-1 bereichern<sup&gt; +</sup&gt; Leukozyten vor der FACS-Sortierung MDSC zur Verwendung<em&gt; In-vivo-</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays.

Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

preparation-myeloid-derived-suppressor-cells-mdsc-from-naive

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

26.1K Aufrufe.  University of South Florida Morsani College of Medicine. Dies ist eine schnelle und umfassende Methode der Immunphänotypisierung Myeloide Suppressorzellen (MDSC) und bereichernde Gr-1 + Leukozyten aus Maus-Milz. Diese Methode verwendet Durchflusszytometrie und autoMACS Zellsortier für tragfähige Gr-1 bereichern + Leukozyten vor der FACS-Sortierung MDSC zur Verwendung In-vivo- Und In-vitro- Assays.

Serie: Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Forschung

Medizin

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Halbautomatische Anpassung der Umlauftumorzellen (CTC)-Assays für die klinische und vorklinische Forschungsanwendungen

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validierung der Nanobody und Antikörper-basierte<em&gt; In-vivo-</em&gt; Tumorxenotransplantat NIRF-Bildgebung Experimente bei Mäusen verwenden<em&gt; Ex vivo</em&gt; Durchflusszytometrie und Mikroskopie

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

Molecular Probe-Optimierung, um Zellmortalität in einem photosynthetische Organismen Bestimmen (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Mittels Durchflusszytometrie

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.