Wir bedanken uns für die Finanzierung von DARPA geförderte Mikro / Nano Fluidics Grundlagen Focus (MF3) Center unter Vertrag Zahl N66001-10-1 bis 4003, und von DARPA Zuschuss N660001-09-C-2082.

1. Physik der ITP ITP bildet eine scharfe Grenze zwischen sich bewegenden Ionen gleicher Ladung. Die Technik kann mit anionischen oder kationischen Proben durchgeführt werden, aber wir passen diese Einführung in anionischen ITP und beachten Sie die gleichen Grundsätze gelten für kationische ITP. Wir wählen LE und TE-Puffer, so dass LE-Ionen höherer Größenordnung effektive elektrophoretische Mobilität haben. Die effektive elektrophoretische Mobilität, μ = U / E, ist die Proportionalitätskonstante zwischen angelegten elektrischen Feldes, E und Ionendriftgeschwindigkeit U. Wir 13 eine diffuse Schnittstelle zwischen dem LE und TE zu etablieren und ein elektrisches Feld aus dem High-Regie Leitfähigkeit LE Zone der geringen Leitfähigkeit TE Zone. Das System schnell für einen starken Gradienten im elektrischen Feld an der ITP-Schnittstelle, durch die nicht-einheitliche Leitfähigkeit Profil. Gemäß ihrem Namen (aus dem Griechischen, &quot;isos&quot; bedeutet &quot;gleich&quot;, &quot;takhos&quot; bedeutet &quot;Geschwindigkeit&quot;), TE und LE-Ionen wandern zur gleichen, einheitlichen velocity, als Folge der nicht-einheitliches elektrisches Feld und die Erhaltung der aktuellen (dies ist die sogenannte &quot;ITP Zustand&quot; ist, siehe 1). Die ITP-Schnittstelle wird selbstschärfende: LE-Ionen, dass in die TE-Zone diffundieren Erfahrung eine starke Wiederherstellung Fluss und kehren Sie zum führenden Zone (und umgekehrt für die TE-Ionen in der LE-Zone). Probenionen an dieser Schnittstelle zu konzentrieren, wenn die effektive Mobilität in der TE-Zone größer als die der TE Co-Ionen, und wenn die effektive Mobilität im LE-Zone geringer ist als die der LE Co-Ionen (siehe 1). Die Selbst-Schärfen und Fokussierung Eigenschaften von ITP tragen zur Robustheit dieser Technik machen und ITP relativ unempfindlich gegen Störungen des Interfaces (zB aufgrund von Druck-driven flow oder Veränderungen in der Geometrie, wie Kontraktionen, Erweiterungen und Wendungen). Im Peak-Modus ITP (siehe Abbildung 2a und Videos 1-2), sind Probe Ionenkonzentrationenzu jeder Zeit deutlich niedriger als LE und TE-Ionen-Konzentrationen und daher vernachlässigbar zur lokalen Leitfähigkeit. Die Verteilung der Probenionen durch die selbstschärfend Schnittstelle zwischen benachbarten Zonen (hier die TE und LE) und dem Wert der Probe wirksamen Beweglichkeit relativ zu diesen Zonen bestimmt. 14 Mehrere Probenionen innerhalb der gleichen schmalen ITP-Schnittstelle Region konzentrieren als weitgehend überlappenden Peaks. Die Schnittstellen-und Peak-Breiten, sowie die damit verbundene Anreicherung Faktor, Maßstab invers mit dem angelegten Strom (siehe Experimente in Abbildung 2b). 14 Für ausreichend hohe Konzentrationen Erstmuster und ausreichende Anhäufung Zeit erreichen Probeionen eine Schwellenkonzentration Wert. Für vollständig ionisierte Spezies, wird dieser Wert durch den Kohlrausch regulierende Funktion (KRF) bestimmt. 15. Für schwache Elektrolyte, es von den Alberty und Jovin Funktionen bestimmt wird. 16,17 in PlateauModus, wie in Abbildung 3 und Video 3, Proben-Ionen zu trennen und in Zonen von lokal gleichmäßige und konstante Konzentration in einer Reihenfolge durch ihre effektive Mobilität bestimmt reinigen dargestellt. Sehr verdünnte Ionen können immer noch in Peak-Modus zwischen Plateau Zonen konzentrieren. In ITP, kann Proben-Ionen in einer endlichen Injektion zwischen dem TE und LE (siehe Abbildung 3) eingeführt werden oder alternativ zusammen mit dem TE und / oder LE (siehe Abbildung 2) gemischt. Wir beziehen sich auf das Mischen in der TE-Zone als &quot;semi-infinite&quot; Injektion verwendet werden, um die Analyt-Ionen kontinuierlich sammeln kann. Continuous Sample Akkumulation erhöht die Empfindlichkeit sowohl in Peak-und Plateau-Modus Assays. Allerdings sind endlich Injektionen häufiger in Plateau-Modus. Dies ist wahrscheinlich, weil hohe Anfangsinvestitionen Analytkonzentrationen in semi-infiniten Injektion erheblich steigern können TE Leitfähigkeit und niedriger Schwerpunkt Raten. Außerdem ist voll Reinigung nicht in semi-infiniten Injektion möglich (da es remaIns eine endliche Konzentration in TE). 2. Geräte-Reinigung und Vorbereitung Für die Tests in diesem Protokoll vorgestellt verwenden wir isotrop nassgeätzt (etwa D-förmigen Querschnitt) Glas-Mikrofluidik-Chips mit einem Cross-Channel-Design (siehe Abbildung 1). Die folgende Reinigung und Herstellung Protokoll für die Mäntel und Quarzglas Kanäle optimiert, kann aber auch mit Glas / PDMS-Chips verwendet werden. Führen Sie diesen Reinigungsvorgang vor Experimenten zu laufen-to-run Wiederholbarkeit und erfolgreiche Anwendung von dynamischen Beschichtungen benötigt, um elektroosmotischen Fluss (EOF) zu unterdrücken, zu gewährleisten. Das Weglassen dieses Protokoll kann in starken Streuung der ITP-Schnittstelle führen. 14 <ol><li> Um den Kanal zu dekontaminieren, füllen Sie den Norden, Osten, Süden und Reservoirs mit 10-20 ul von 10% Bleichmittel und gelten Vakuum an der West-Reservoir für 2 min. Wenn über einen Standard-Chip Caliper Wechselrahmen, kann Vakuum effektiv, indem Sie einfach attachin angewendet werdeng das breite Ende einer 200 ul (ungefilterten) Pipettenspitze mit dem Chip Reservoir und Verbinden der Vakuumleitung an einer 2 mm Innendurchmesser Rohr. </li><li> Leeren Sie den Behälter und spülen Sie den Kanal (wie in Schritt 1) ​​mit 1 M Natronlauge für 2 min. Dieser sanft ätzt die Kanalwände, was eine saubere Oberfläche zu helfen, Borosilicatglas einheitliche Oberflächeneigenschaften. </li><li> Leeren Sie den Behälter und sauber und mit deionisiertem Wasser (DI), dann spülen Sie den Kanal mit LE für ~ 2 min. Während dieser Zeit Oberflächeneigenschaften und dynamischen Beschichtungen innerhalb des Kanals ins Gleichgewicht. </li></ol> 3. Fluorophor Schwerpunkt im Peak-Modus ITP <ol><li> Planen 1 ml LE, bestehend aus 100 mM HCl, 200 mM Tris und 1% PVP. </li><li> Planen 1 ml TE, bestehend aus 100 mM HEPES und 200 mM Tris. Kombinieren Sie 90 ul TE mit 10 ul 1 pM Alexa Fluor 488 (AF488). </li><li> Nach dem Spülen mit LE wie beschrieben in Teil 2, leeren Sie den West-Reservoir und reinigen Sie ein paar Mal mit DI in oderder zu verdünnen jede LE noch im Reservoir. Füllen Sie dieses Reservoir mit 20 ul TE mit AF488. </li><li> Legen Sie die positive Elektrode im Osten Reservoir und den Boden (negativen) Elektrode in der West-Reservoir und 2 gelten uA (Konstantstrom). Die Probe wird Peak bei einer konstanten Geschwindigkeit von Westen nach Osten Reservoir Reservoir (siehe Abbildung 1) und die Spannung zwischen dieser Lagerstätten erhöhen, da der geringere Leitfähigkeit TE füllt den Kanal zu migrieren. </li></ol> 4. Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus kultivierten E. coli Die Fähigkeit zur selektiven Fokus Ionenarten macht ITP eine ideale Technik für biologische Probenaufbereitung. Wir Aufreinigung von Nukleinsäuren aus unbehandelten Zell-Lysat durch die ein hinteres Anion mit einer effektiven Mobilität Größenordnung niedriger als der Ziel-Nukleinsäure, aber höher als Co-ionischen PCR-Inhibitoren (zB anionische Detergenzien, Proteinen und organischen Lösungsmitteln, auch wenn in HalloGH-Konzentration). Kationische PCR-Inhibitoren (zB Alkalimetalle und kationische Proteine ​​und Detergenzien) in die entgegengesetzte Richtung wandern und sind somit ebenfalls zurückgelassen. ITP extrahiert und konzentriert sich Zielnukleinsäuren aus dem Probenbehälter, wobei aber langsamer PCR-inhibierenden Spezies hinter (siehe Abbildung 4). <ol><li> Besorgen Sie sich eine Probe der Kultur oder E. coli-Zellen auf eine Dichte größer als 10 8 CFU / ml. </li><li> 1 ml Zellkultur in einen Safe-Lock-Mikrozentrifugenröhrchen und Pellet durch Zentrifugation bei 4000g für 6 min. </li><li> Resuspendieren Sie das Pellet in 80 ul RNase-freies Wasser und fügen Sie 10 uL Lysemittels bestehend aus 10 mM Tricin, 10 mM Bis-Tris, 2 mM EDTA, 0,1% Triton-X, und 5 mg / ml Lysozym. Vorsichtig mischen und inkubieren Sie für 5 Minuten. bei Raumtemperatur (Lysieren Protokoll von Bercovici et al ausgebildet. 11). </li><li> Fügen Sie 10 ul 1 M Natronlauge auf pH-Wert des Lysats auf ~ 12,5 zu erhöhen. Vorsichtig betätigen Sie die Pipette auf und ab, bisdie Lösung klar wird, wobei an diesem Punkt Lyse abgeschlossen ist. </li><li> Kombinieren Sie 10 ul Lysat mit 90 ul 50 mM Tricin und 100 mM Bis-Tris. Diese Lösung kann nun als TE verwendet werden. </li><li> Planen 1 ml LE, bestehend aus 500 mM bis-Tris, 250 mM HCl, 1% PVP und 1X SYBR Green II. Füllen Sie den Mikrofluidik-Chip mit LE wie in Teil 3 beschrieben. </li><li> Um die gereinigte Nukleinsäure für Off-Chip-Analyse zu extrahieren nach ITP, ersetzt den Inhalt des Reservoirs Osten mit einem PCR-kompatiblen LE, enthaltend 50 mM Bis-Tris, 25 mM HCl und 0,1% PVP. Bewerben 1000 V zwischen Ost und West Brunnen, um das Experiment zu beginnen. Der Strom zwischen diesen Lagerstätten nimmt ab. </li><li> Am Ende des Experiments die Probe eluiert in das Reservoir LE. Gleichzeitig mit dieser Elution, die derzeitige Abhängigkeit von der Zeit für dieses System in der Regel erreicht ein Plateau-Wert (da jetzt Widerstand wird durch TE-Ionen gleichmäßig im Kanal verteilt dominiert). Vorsichtig mischen das ReservoirInhalt durch wiederholtes Pipettieren und extrahieren Sie eine 5-ul-Volumen für die Analyse durch quantitative RT-PCR. </li></ol> 5. Trennung von Aminosäuren mit kationischen Plateau-Modus ITP und nicht fokussierenden Tracer (NFT) zur Visualisierung ITP kann verwendet werden, zu trennen und zu konzentrieren kleinen Ionen in angrenzende und nachweisbar Plateaus zwischen dem TE und LE werden. Dies ermöglicht die Erkennung und Identifizierung auf der Basis physikalisch-chemischen Eigenschaften, wie z. B. lokale Leitfähigkeit, UV-Absorption, Temperaturerfassung oder Brechungsindex. Hier zeigen wir eine nicht fokussierenden Tracer (NFT) Assay, wobei eine fluoreszierende, Co-ionischen Spezies der LE zugegeben wird. Das fluoreszierende Spezies nicht konzentrieren, sondern seine Konzentration passt zu einem lokalen elektrischen Feldes und damit ermöglicht die Visualisierung von gereinigtem Plateau Zonen (siehe Abbildung 5). <ol><li> Bereiten Sie 1 mL LE, bestehend aus 100 mM Ethanolamin, 200 mM Tricin, und 1% PVP und 100 uM des kationischen Fluorophor Rhodamin 6G. </li> &lt;li&gt; Prepare 1 ml TE bestehend aus 20 mM Tris, 40 mM Tricin. Bereiten Probe durch Mischen von 90 ul TE mit 10 ul jeder der 50 mM Arginin und 50 mM Lysin. </li><li> Dispense 20 uL LE in der West-und Nord Stauseen und Probe in der Ost-Reservoir. Bewerben Vakuum bei Süd Reservoir für 1 min. </li><li> Spülen Sie den Osten gut mit DI und ersetzen mit TE (TE ohne Probe). </li><li> Bewerben 500 V zwischen Ost und West Stauseen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Wir zeigen isotachopherograms Peak-Modus von Experimenten in der 2b und Nukleinsäure-Extraktion Experimente in Abbildung 4. Im Peak-Modus Experimenten mit einem fluoreszierenden Reporter (zB AF488, SYBR Green II), den gesamten Fluoreszenzintensität integriert und gegen eine Kalibrationskurve, quantitative Informationen zu erhalten Konzentration verglichen werden. 12, die zusätzlich in Nukleinsäureextraktion Experimenten wird die Probe erlaubt, zu eluieren in ter LE Reservoir extrahiert und mit einer Pipette zur Analyse durch quantitative RT-PCR. 10,12 Wir zeigen, Plateau-Modus isotachopherograms für Aminosäure Trennung in Abbildung 5. Fluoreszenz-Intensität (bezogen auf LE oder TE Zone Intensität) kann für die Zone Identifikation verwendet werden, während Zonenbreiten ermöglichen Quantifizierung. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig1.jpg" /> Abbildung 1. Isotachophorese (ITP) ist eine elektrokinetische Technik in mikrofluidischen Anwendungen für die sensitive Detektion und Separation von Ionen verwendet. ITP bietet Trennung, selektive Fokussierung, und Anreicherung Fähigkeiten. Darüber hinaus ist es äußerst robust und unempfindlich gegen physische Störungen wegen seiner selbstschärfend Natur. Beispiel Ionen selektiv zwischen einem vorderen (LE) und die hintere Elektrolyten (TE) und wandern durch den Mikrokanal mit einer konstanten Geschwindigkeit von der Geschwindigkeit der Ionen in der führenden Zone bestimmt LE konzentrieren. Probeionenkonzentrieren, wenn ihre effektive elektrophoretische Mobilität durch die effektive Mobilität der LE und TE-Ionen geklammert wird. Das Schema zeigt ein Modell ITP Experiment, bei dem Probe fokussiert kontinuierlich zwischen der LE und TE-Zonen. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig2.jpg" /> Abbildung 2. Verdünnen Probeionen Fokus in &quot;Peak-Modus&quot; ITP. a) Zwei verschiedene verdünnte (c &lt;&lt; Probe c LE)-Spezies Schwerpunkt Peak-Modus an der Grenzfläche zwischen dem LE und TE Zonen gebildet. Lediglich die LE und TE bestimmen das elektrische Feld, wie Probenspezies nicht wesentlich zur aktuellen beitragen. Probenionen sind, gemischt mit TE (in einem semi-infiniten Injektion) und sich gemeinsam in einer etwa Gauß-Peak bei der ITP-Schnittstelle. Die Fokussierung Kriterium (dargestellt als Ungleichheiten) gilt für stark ionisierten Spezies. b) Die Experimente zeigen, Alexa Fluor 488 (AF488) im Peak-Modus für eine Reihe von angelegten Ströme fokussiert (siehe auch Video 1). Beispiel Peakbreite ist umgekehrt proportional zum Strom (für vernachlässigbar advektiven Dispersion aufgrund des elektroosmotischen Flusses). 14 Die Selbst-Schleifen-Schnittstelle ist beständig gegen Dispersion durch Druck-Grundwasserströmung (siehe Video 2). <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig3.jpg" /> Abbildung 3. Probeionen bei einer ausreichend hohen Konzentration im Fokus &quot;Plateau-Modus&quot; und regieren lokale Leitfähigkeit. Wir stellen in der Regel Proben-Ionen in einer endlichen Injektion zwischen dem TE und LE. In dieser Modalität, Proben-Ionen getrennt und damit entsprechend ihrer effektiven elektrophoretischen Mobilität (siehe Video 3). Bei stark ionisierten Arten sind die TE-und Plateau-Zone Konzentrationen durch den Kohlrausch regulierende Funktion (KRF, eine invariante Menge zunächst von der LE-Zone) ermittelt. Verdünnten Ionen weiterhin in Peak-Modus zwischen Plateau Zonen Bracketing ihre effektive Mobilität konzentrieren. Die Konzentration criterion (dargestellt als Ungleichheiten) gilt für stark ionisierten Spezies. <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig4.jpg" /> Abbildung 4. Lysatpräparat und Nukleinsäure-Extraktion mit Peak-Modus ITP. Nucleinsäure ist aus E. extrahiert coli-Zellkultur mit Lysozym-unterstützte alkalische Lyse und gereinigt durch selektive elektrophoretische Fokussierung über ITP. TE mit Lysat gemischt (braun) enthält Zielnukleinsäure (grün), Proteine ​​und mögliche PCR-inhibierende Chemikalien. Durch geeignete Wahl der hinteren und vorderen Ionen ermöglicht selektives Fokussieren von Zielnukleinsäure während verlassen PCR-Inhibitoren zurück. Insgesamt Nukleinsäure ITP Gipfel dauert oft auf einer nicht-idealen Form, wie hier im Einsatz-Bild gezeigt. Zur Demonstration dieses Assays haben wir gesamten Nukleinsäure extrahiert aus gram-negativen Bakterien, gesammelt Escherichia coli (lysiert mit Natronlauge allein), gereinigt aus dem Lysat mit NA ITP,das genetische Material extrahiert und durchgeführt qRT-PCR-Analysen für eine erfolgreiche Aufreinigung von 16S-rRNA (rot) und 16S rDNA (grün) aus Bakterienkultur zu überprüfen. Negative Kontrolle Schwelle Zyklen für 16S rRNA (blau) und 16S rDNA (gelb) wurden jeweils über 30 Zyklen. Wir führten qRT-PCR mit SYBR Green Power-RNA-to-C T 1-Step Kit von Applied Biosystems mit 150 nM forward (5&#39;-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) und reverse (5&#39;-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) Primer, bei den empfohlenen Bedingungen Temperaturzyklen. <img alt="Abbildung 5." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig5.jpg" /> Bild 5. Nicht-konzentrieren Tracer (NFT) Assay für Trennung und Detektion von unmarkiertem Aminosäuren. a) Schematische Darstellung der NFT-Assay. Eine endliche Injektion von Proben-Ionen wird in den Ost-Kanal eingeführt. Wir mischen die LE mit einem Tracer kationische Fluorophor mit einer effektiven Mobilität niedriger als die TE-Ionen (μ-Tracer &lt;μ TE). Der Fluorophorsoll als &quot;Unterbeschleunigung Tracer&quot; zu handeln. Als das Fluorophor electromigrates dem LE in Zonen nun Probe Plateaus und TE besetzt, erfährt es einen höheren elektrischen Feld und somit die Konzentration zunimmt. Diese Änderung in der Konzentration erzeugt Schritte in der isotachopherogram. b) Trennung von zwei Aminosäuren Arginin und Lysin, mit der NFT-Assay mit Rhodamin 6G als Unterbeschleunigung fluoreszierender Tracer. Die leichte Spitze zwischen TE und Arginin ist in ITP häufig, ist nicht gut verstanden, und hier nicht mit Nachweisen oder Quantifizieren des Plateaus stören. Supplemental Movie 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie1.mpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um die zusätzlichen Film anzusehen</a> . Supplemental Movie 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie2.mpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um die zusätzlichen Film anzusehen</a> . Supplemental Movie 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie3.mpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um die zusätzlichen Film anzusehen</a> .

<ol>
	<li>Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+millionfold+sample+stacking+using+transient+isotachophoresis.">On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).</li><li>Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+100+am+fluorophores+using+a+high-sensitivity+on-chip+CE+system+and+transient+isotachophoresis.">Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).</li><li>Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotachophoresis:+Theory,+instrumentation,+and+applications.">Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications.</a> Elsevier Science &#38; Technology. , (1976).</li><li>Khurana, T. K., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration,+separation,+and+indirect+detection+of+nonfluorescent+analytes+using+fluorescent+mobility+markers.">Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers.</a> Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).</li><li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carrier+ampholytes+assay+for+portable,+label-free+detection+of+chemical+toxins+in+tap+water.">Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water.</a> Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).</li><li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+analyte+identification+using+isotachophoresis+and+a+fluorescent+carrier+ampholyte+assay.">Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay.</a> Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).</li><li>Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+system+for+isotachophoresis+assays.">Miniaturized system for isotachophoresis assays.</a> Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).</li><li>Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+quantification+of+isotachophoresis+zones+using+nonfocusing+fluorescent+tracers.">Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers.</a> Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).</li><li>Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+extraction,+isolation,+preconcentration,+and+quantitation+of+small+RNAs+from+cell+lysate+using+on-chip+isotachophoresis.">Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis.</a> Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).</li><li>Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+nucleic+acids+from+whole+blood+using+isotachophoresis.">Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).</li><li>Bercovici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+urinary+tract+infections+using+isotachophoresis+and+molecular+beacons.">Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).</li><li>Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+malaria-infected+erythrocytes+using+isotachophoresis.">Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).</li><li>Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+electrolyte+chemistry+for+microfluidic+electrokinetics.+Part+I:+Acid-base+equilibria+and+pH+buffers.">Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers.</a> Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).</li><li>Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+dispersion+in+isotachophoresis.">Sample dispersion in isotachophoresis.</a> J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).</li><li>Kohlrausch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+concentrations-verschiebungen+durch+electrolyse+im+inneren+von+l&#214;sungen+und+l&#214;sungsgemischen.">&#220;ber concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von l&#214;sungen und l&#214;sungsgemischen.</a> Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).</li><li>Alberty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+boundary+systems+formed+by+weak+electrolytes.+Theory+of+simple+systems+formed+by+weak+acids+and+bases.">Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).</li><li>Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+zone+electrophoresis.+I.+Steady-state+moving-boundary+systems+formed+by+different+electrolyte+combinations.">Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations.</a> Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).</li><li>Persat, A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+by+simultaneous+selective+isotachophoresis+and+hybridization+with+molecular+beacons.">MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons.</a> Anal. Chem. , (2011).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die ITP hier vorgestellten Methoden ermöglichen eine schnelle, empfindliche und robuste Erkennung und Behandlung von ionischen Molekülen. Die größte Herausforderung im Umgang mit ITP ist die richtige Wahl des LE und TE-Puffer. In anionischen ITP, wählen wir in der Regel Chlorid als führende Anion, weil es eine starke Säure mit einer sehr hohen absoluten Mobilität ist und somit sehr vorhersagbaren Eigenschaften. Daher wird in Puffer Wahl anionischen ITP in der Regel um die Wahl eines geeigneten TE und Gegenion reduziert. Für die selektive Fokussierung Experimente, ist entscheidend für die Wahl TE Ausschluss von verunreinigenden Ionen. In Anwendungen, bei denen Verunreinigungen sind nicht vorhanden, führt unteren TE effektive Mobilität auf schnellere Fokussierung. Wir empfehlen die Verwendung der folgenden, relativ brav anionische TE-Ionen: MES, MOPS, HEPES, Tricin. Wahl des Gegenions beeinflusst sowohl die System-und pH-TE effektive Mobilität. Gemeinsame Gegenionen sind Tris (pKa 8.1) und Bis-Tris-(pKa 6.4). Für Tests, die einen niedrigen oder höheren pH-Wert, empfehlen wir Pyridin (pKa 5,25) undEthanolamin (pKa 9,5), jeweils. In den Tabellen 1 und 2, für anionische und kationische ITP, jeweils fassen wir einige nützliche Beispiele Puffer. Wir nehmen HCl als anionische LE Ionen und Natrium als kationische LE-Ion, und wir nehmen an 100 mM Ionenstärke der LE-Puffer. Der Leser wird bemerken, dass Puffer Ionenstärke in unserer Protokolle (und in den Tabellen 1-2) immer größer als oder gleich 10 mM. Während in der Theorie die Physik der ITP gilt bei Ionenstärke kleiner als 10 mm, natur Verunreinigungen (z. B. Kohlensäure aus Reaktion zwischen Wasser und atmosphärischem Kohlendioxid) in der Nähe der 1 mM Ebene beschränken oft den praktischen Einsatz von Puffern niedriger Ionenstärke. Man beachte, daß Signaltransduktionsmechanismus nicht auf die Assays in diesem Protokoll vorgestellt beschränkt. Wie bereits kurz in Teil 5, in Plateau-Modus gereinigt Zonen diskutiert über Änderungen in der lokalen Leitfähigkeit, UV-absor erkannt werdenBance, der Temperatur oder des Brechungsindex. In unserer eigenen Gruppe, haben wir eine Methode, die fluoreszierende Trägerampholyten nutzt für empfindliche Detektion und Identifizierung von unbekannten Analyten entwickelt. 5 Im Peak-Modus Experimente, spezifischen Sonden verwendet werden, um konzentriert Analyten zu markieren. In einem Beispiel verwenden wir Molecular Beacons - Oligonukleotid-Sonden, die bei Hybridisierung fluoreszieren, um ihre Ziel-Sequenz - auf Ziel-DNA-oder RNA-Moleküle mit hoher Spezifität erkennen 11,18. Während ITP ist relativ robust gegenüber Dispersion durch Druck-gesteuerte Strömungs-und EOF verursachten übermäßigen EOF zu einer Stagnation des ITP-Schnittstelle, wo die mittlere Geschwindigkeit EOF gleich der ITP Geschwindigkeit führen. Solche starken EOF 14 tritt vor allem bei hohem pH-Wert und niedriger Ionenstärke. Aus diesem Grund empfehlen wir die Verwendung von Puffern mit pH 8 oder niedriger und mit Ionenstärke in der Größenordnung von 100 mm, wenn praktisch. Nach unserer Erfahrung ist das PVPeffektivste Beschichtung für EOF-Unterdrückung in Borosilikat-Chips. Da jedoch der Siebeigenschaften kann PVP nicht für alle Anwendungen geeignet, wie die Fokussierung genomische DNA ist. In Experimenten beobachten wir, dass die Zugabe von PVP stark herabsetzen kann genomische DNA absolute Mobilität (bis zu dem Punkt, wo es nicht konzentrieren muss). In diesen Fällen ein Silanol Beschichtung wie Sigmacote in Verbindung mit einem Tensid (z. B. Triton X-100) kann auch wirksam bei der Verringerung EOF. 10 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE-Anion (pKa -1) </td></tr><tr><td> Pufferung Gegenion (pKa +1) </td><td> MES (6,10) </td><td> MOPS (7.20) </td><td> HEPES (7,50) </td><td> Tricin (8,15) </td></tr><tr><td> Ethanolamin (9.50) </td><td> 21,41 </td><td> 20,40 </td><td> 17,38 </td><td> 22,85 </td></tr><tr><td> Tris (8,08) </td><td> 21,00 </td><td> 19,23 &lt;/ Td&gt; <td> 15,84 </td><td> 17,56 </td></tr><tr><td> Bis-Tris-(6,40) </td><td> 18,22 </td><td> 10,41 </td><td> 7,30 </td><td> 5,23 </td></tr><tr><td> Pyridin (5,18) </td><td> 1,01 </td><td> 3,72 </td><td> 2,42 </td><td> 1,48 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Effektive Mobilität Größenordnung (× 10 -9 m 2 / V / s) des bereinigten reinen Analyten in anionischen ITP Zone, wo die LE ist 100 mM HCl und 200 mM Puffern Gegenion. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE-Kation (pKa +1) </td></tr><tr><td> Pufferung Gegenion (pKa -1) </td><td> Ethanolamin (9.50) </td><td> Tris (8,08) </td><td> Bis-Tris-(6,40) </td><td> Pyridin (5,18) </td></tr><tr><td> MES (6,10) </td><td> 35,57 </td><td> 21,96 </td><td> 16,39 </td><td> 10,45 </td></tr><tr><td> MOPS (7.20) </td><td> 35,47 </td><td> 20,92 </td><td> 9,76 </td><td> 3,93 </td></tr><tr><td> HEPES (7,50) </td><td> 35,35 </td><td> 19,97 </td><td> 7,77 </td><td> 2,88 </td></tr><tr><td> Tricin (8,15) </td><td> 34,77 </td><td> 16,72 </td><td> 4,50 </td><td> 1,44 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Wirksame Mobilität Größe (× 10 -9 m 2 / V / s) des bereinigten reinen Analyten Zone in kationische ITP wobei das LE 100 mM Natriumphosphat und 200 mM Puffer Gegenion.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> REAGENZIEN </td></tr><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> RNase / DNase frei </td></tr><tr><td> Clorox Ultra- </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> Salzsäure (HCl) </td><td> EMD Chemicals </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma Basis (Tris) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidon (PVP) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 06067 </td><td> 1.000.000 MW </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Carbonsäure </td><td> Invitrogen </td><td> ± 20000 </td><td></td></tr><tr><td> Tricin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> Lysozym </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanolamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamin 6G </td><td> Acros Organics (Geel, Belgien) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-Aminosäuren </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green Power-RNA-to-C T 1-Step Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; PCR-Primer </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Borosilikat Mikrofluidik-Chip </td><td> Caliper Life Sciences Inc. </td><td> NS12A </td><td> Lieferbar mit oder ohne Kunststoff-Wechselrahmen </td></tr><tr><td> Vakuumpumpe </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> Sourcemeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> Konstantem Strom und konstanter Spannung Betriebsarten </td></tr><tr><td> Inverted epifluoreszenten Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> IX70 </td><td> Verwenden Sie Quecksilberlampe (Olympus) oder LED (Thorlabs) für die Beleuchtung </td></tr><tr><td> Filter Würfel </td><td> Omega </td><td> XF115-2 </td><td> Anregung / Emission: blau / grün </td></tr><tr><td> Sicher-Lock Gefäß </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> 1,5 ml Kapazität </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Reagenzien und Geräte.

on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids

Elektrokinetischen Techniken sind ein Grundnahrungsmittel der mikro-Anwendungen aufgrund ihrer einzigartigen Fähigkeit, eine Vielzahl von fluidischen und elektrophoretische Prozesse in einfache, kompakte Systeme ohne bewegliche Teile durchführen. Isotachophorese (ITP) ist eine einfache und sehr robust elektrokinetische Technik, die Millionen-fache Anreicherung 1,2 und effiziente Trennung und Extraktion auf Ionenbeweglichkeit Basis erreichen können. 3 Zum Beispiel haben wir die Anwendung der ITP zu Trennung und sensitiven Nachweis von unmarkiertem demonstriert ionischen Molekülen (z. B. Toxine, DNA, rRNA, miRNA) mit wenig oder gar keine Probenaufbereitung und 08.04 bis Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus komplexen Matrices einschließlich der Zellkultur, Urin und Blut. 9-12 ITP erzielt Fokussierung und Trennung unter Verwendung eines angelegten elektrischen Feldes und zwei Puffer innerhalb eines fluidischen Kanal-System. Für anionische Analyten, ist der führende Elektrolyten (LE) Puffer gewählt such, dass die Anionen höhere effektive elektrophoretische Mobilität als die Anionen des hinteren Elektrolyten (TE)-Puffer (Effektive Mobilität beschreibt die beobachtbaren Driftgeschwindigkeit eines Ions und berücksichtigt die Ionisierung Zustand des Ions, wie ausführlich von Persat et al haben . 13). Nach Einrichtung einer Schnittstelle zwischen dem TE und LE, wird ein elektrisches Feld angelegt, so dass LE Ionen weg von der Region von TE-Ionen besetzt. Probenionen der mittleren effektiven Mobilität Rennen vor TE-Ionen, aber nicht überholen können LE-Ionen, so daß sie an der LE-TE-Schnittstelle (im Folgenden als &quot;ITP-Schnittstelle&quot;) zu fokussieren. Ferner wird der TE und LE Form von Regionen bzw. niedriger und hoher Leitfähigkeit, die einen steilen Gradienten des elektrischen Feldes an der ITP-Schnittstelle zu etablieren. Diese Feldgradienten Vorkonzentrate Probe Spezies, wie sie zu konzentrieren. Die richtige Wahl der TE und LE führt zu konzentrieren und Reinigung von Zielarten aus anderen Nicht-fokussierte Arten und schließlich die Trennung eind Trennung der Probenspezies. Wir überprüfen hier die physikalischen Grundlagen ITP und diskutieren zwei Standard-Betriebsarten: &quot;Peak&quot; und &quot;Plateau&quot;-Modi. Im Peak-Modus, relativ verdünnte Proben-Ionen konzentrieren gemeinsam innerhalb überlappenden schmalen Peaks bei der ITP-Schnittstelle. In Plateau-Modus, erreichen häufiger Probeionen eine stationäre Konzentration und trennen in angrenzende Plateau-Zonen, die durch ihre effektive Mobilität bestellt. Peak-und Plateau-Modi ergeben sich aus den gleichen zugrunde liegenden Physik, sondern stellen verschiedene Regimes durch die anfängliche Analytkonzentration und / oder der Höhe der Zeit für die Probe zugeteilt Akkumulation unterschieden. Wir erstmals im Detail ein Modell Peak-Modus Experiment beschreiben und dann zeigen, Peak-Modus-Assay für die Extraktion von Nukleinsäuren aus E. coli Zellkultur. Wir schließen daraus, durch die Vorlage eines Plateau-Modus-Test, wo wir eine Nicht-Fokussierung Tracer (NFT) Arten, die Trennung zu visualisieren und nutzen probilden Quantifizierung von Aminosäuren.

Watch this Scientific Journal Video about On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids at JoVE.com

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Isotachophorese (ITP) ist eine robuste elektrokinetischen Trennung und Anreicherungstechnik mit Anwendungen, die von Toxinnachweis zu Probenvorbereitung. Wir prüfen die physikalischen Grundlagen der ITP und die Methodik der Anwendung dieser Technik auf zwei konkrete Anwendungsbeispiele: Trennung und Detektion von kleinen Molekülen und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus Zellkultur-Lysat.

On-chip Isotachophorese für Separierung von Ionen und Aufreinigung von Nukleinsäuren

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

on-chip-isotachophoresis-for-separation-ions-purification-nucleic

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Current and Resistance

SCIENTISTS IN ACTION

24.2K Aufrufe.  Stanford University. Isotachophorese (ITP) ist eine robuste elektrokinetischen Trennung und Anreicherungstechnik mit Anwendungen, die von Toxinnachweis zu Probenvorbereitung. Wir prüfen die physikalischen Grundlagen der ITP und die Methodik der Anwendung dieser Technik auf zwei konkrete Anwendungsbeispiele: Trennung und Detektion von kleinen Molekülen und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus Zellkultur-Lysat.

Serie: On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Forschung

Biotechnik

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree On-Chip-tomographischen Mikroskopie beschäftigt Multi-Angle-Beleuchtung und Super-Pixel-Auflösung

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

On-Chip-Endothelial Entzündliche Phänotypisierung

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Kapillar Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Vorbereitung, Reinigung und Anwendung von Fettsäure-haltigen Liposomen

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Gleichzeitige Quantifizierung ausgewählter Kynurenine, analysiert durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

Selbstmontage von Gamma-modifizierten Peptid-Nukleinsäuren in komplexe Nanostrukturen in organischen Lösungsmittelmischungen

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.