Wir danken der Whitehall Foundation aufrichtig für ihre finanzielle Unterstützung und Start-up-Mittel vom Scripps Research Institute für die Durchführung dieser Arbeit.

1. Vorbereitung von Abdominal Ganglia, elektrophysiologische Messungen und Isolierung von Single Identified Neurons from Abdominal Ganglion of Aplysia californica
<ol><li>Aplysie im Laboraquarium mit zirkulierendem künstlichem Meerwasser (ASW) bei 16 °C unter 12:12 Licht:dunkel halten.</li>
	<li>Isolierung von Bauchganglien.<ol>
<li>Anästhesisieren Sie Tiere durch Injektion von 380 mM MgCl2 Lösung für 5-10 min (entspricht 30-35% des Körpergewichts des Tieres).</li>
		<li>Identifizieren Sie das Bauchganglien basierend auf seiner Position im zentralen Nervensystem24,28.</li>
		<li>Entfernen Sie die Ganglien durch chirurgische Operation und lagern Sie sofort in künstlichem Meerwasser bestehend aus 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3und 10 mM HEPES (pH 7.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protease-Behandlung.<ol>
<li>Inkubieren Bauchganglien für 30 min bei 34 °C±0,5 in einer Petrischale mit 0,1% Protease (Dispase) in ASW beschrieben oben beschrieben. HINWEIS: Die Menge der verwendeten Protease muss mit dem Alter und Gewicht der Tiere standardisiert werden. Im Allgemeinen würden ältere und größere Tiere mehr Protease benötigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernung von Ganglienscheide.<ol>
<li>Nach der Enzymbehandlung die Ganglien auf die Sylgard-Silikonbasis einer Zellkammer (= 1 cm; Vol. = 0,3 ml) festsetzen und mit ASW (Durchflussrate: 150 l/min) bei Raumtemperatur (18 °C±2 ) durchdringen. HINWEIS: Um die Sichtbarkeit der identifizierten Neuronen zu erhöhen, legen Sie das Ganglien auf die Oberseite eines Polycarbonat-Glaszylinders (Abbildung 1) (Durchmesser = 2 mm modifizierte Zellkammer), die mit einem binokularen Stereomikroskop mit 20-facher und 40-facher Vergrößerung leicht von unten beleuchtet werden kann.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig den Mantel aus dem Ganglion mit Zangen und Mikroschere.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung von zwei Neuronen.<ol>
<li>Identifizieren Sie Neuron von Interesse.</li>
		<li>Impale das Neuron mit einer einzigen intrazellulären scharfen Mikroelektrode mit Widerstand 10-15 M, gefüllt mit 3 M KCl-Lösung.</li>
		<li>Aufzeichnen der neuronalen Aktivität (10 kHz Bandpass) mit einem intrazellulären Aufzeichnungssystem.</li>
		<li>Verarbeiten Sie die Aufzeichnungsdaten mit einer elektrophysiologischen Software wie Axograph. HINWEIS: Man kann leicht Aufnahmen von mehreren Neuronen durchführen. Die Neuronen L7, L11 oder R15 und R2 lassen sich anhand ihrer Position leicht identifizieren. Für die gleichzeitige Aufnahme von zwei L7- und R15-Neuronen werden zwei Verstärker und zwei Mikromanipulatoren benötigt (Abbildung 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drogenanwendung.<ol>
<li>Tragen Sie ein Medikament der Wahl durch sanftePipettierung oder direkte Injektion in Neuronen in die Zellkammer auf.</li>
		<li>Führen Sie elektrophysiologische Messungen durch. HINWEIS: Je nach versuchsweisem Ziel könnte man verschiedene elektrophysiologische Parameter von Neuronen messen, wie z. B. die Veränderungen des Membranpotenzials (MP) oder des Aktionspotentials (AP) vor, während und nach der Anwendung des Arzneimittels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolierung einzelner Neuronen.<ol>
<li>Am Ende der elektrophysiologischen Experimente, stoppen Sie die Perfusion von ASW und waschen Sie das Ganglien mit 100% Ethanol.  Die Exposition gegenüber Ethanol versteinert die Neuronen und macht es mit feinen Zangen einfach, einzelne Neuronen zu entfernen, ohne andere Neuronen aus dem Ganglion zu beschädigen.</li>
		<li>Entfernen Sie einzelne Neuronen unter einem Stereomikroskop und übertragen Sie sie in eine kleine Eppendorf-Röhre, die eiskaltes 500-l-RNA-Extraktionsreagenz enthält. Isolierte Einzelneuronen können für zukünftige Analysen in RNA-Extraktionsreagenz bei -80 °C gespeichert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. RNA-Isolation aus Einzelnen Neuronen und Genexpressionsanalyse durch quantitative Real Time PCR (qPCR)
<ol><li>Vorsichtsmaßnahmen zur Minimierung des RNA-Abbaus: Ribonukleasen (RNasen) abbauen die RNA und sind sehr stabile und aktive Enzyme. Führen Sie die folgenden Schritte bei der Behandlung von RNAs aus.<ol>
<li>Reinigen Sie den Arbeitsbereich und die Instrumente mit RNase-Deaktivierungsmitteln.</li>
		<li>Tragen Sie beim Umgang mit RNA jederzeit Handschuhe und wechseln Sie oft handschuhe.</li>
		<li>Verwenden Sie nur RNase-freie Kunststoffe, um RNAs zu handhaben.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung der Total-RNA aus einzelnen Neuronen:<ol>
<li>Standard-Trizol-Protokoll für RNA-Isolierung kann verwendet werden, um RNAs aus einzelnen Neuronen zu isolieren. Kurz 20% v/v Chloroform zu Trizol hinzufügen, durch kurzes Wirbeln gut vermischen.</li>
		<li>Legen Sie die Rohre 10 min bei 4 °C auf den Rotator. Die Trizol-Chloroform-Mischung bei 12.000 x g 15 min bei 4 °C drehen.</li>
		<li>Sammeln Sie die wässrige Phase und übertragen Sie in ein frisches Rohr.</li>
		<li>Natriumacetatlösung (pH 5.5) zu einer Endkonzentration von 0,3 M, 100 ng/ml des Coprecipitantglycos GlycoBlue und 2,5 Volumen von 100% Ethanol hinzufügen, um DIE RNA auszufällen.</li>
		<li>Mischen Sie die Proben gut und brüten Sie bei -80 °C über Nacht.</li>
		<li>Drehen Sie die Proben bei 12.000 x g für 20 min bei 4 °C und ein kleines blaues Pellet wird an der Unterseite des Rohres sichtbar sein.</li>
		<li>Den Überstand entfernen und das Pellet mit 850 l 75% eiskaltem Ethanol bei 12.000 x g 10 min bei 4 °C waschen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und trocknen Sie das RNA-Pellet für maximal 7-10 min. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die RNA nicht lange zum Trocknen als über- dasTrocknen des RNA-Pellets macht die Löslichkeit sehr schwierig.
</li>
		<li>Nach dem Trocknen setzen Sie das RNA-Pellet in 10 l RNAs freies Wasser wieder auf und bestimmen die RNA-Konzentration. HINWEIS: Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Wenn Sie die RNA nicht sofort verwenden, lagern Sie die RNA bei -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>aRNA-Synthese aus einzelnen Neuronen:<ol>
<li>Amplizieren Sie die RNA (eine oder zwei Runden je nach experimentellem Ziel) mit dem handelsüblichen linearen RNA-Verstärkungssystem. HINWEIS: Die gesamte RNA aus einzelnen Neuronen reichte von 10-60 ng. Die erwartete Ausbeute der ersten Amplifikationsrunde beträgt 100-300 ng und die zweite Verstärkerrunde beträgt 0,8-1,5 g RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Reverse Transkription der RNA:<ol>
<li>Um cDNA aus aRNA zu erzeugen, verwenden Sie 1,0 g aRNA in 20 l einer umgekehrten Transkriptionsreaktion. Mehrere Kits sind für diesen Zweck im Handel erhältlich. HINWEIS: cDNA wurde gemäß dem Herstellerprotokoll unter Verwendung der folgenden Einstellungen auf Thermocycler synthetisiert. 5 min bei 25 °C 30 min bei 42 °C 5 Min. bei 85 °C Halten bei 4 °C</li>
		<li>Nach dem umgekehrten Transkriptionsschritt die cDNA bei -20 °C für eine Langzeitlagerung aufbewahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Primer-Design und Standardisierung: Für die Entwicklung von Primern für Echtzeitverstärkungen stehen ihnen kostenlos mehrere hervorragende Softwareprogramme zur Verfügung.<ol>
<li>Wählen Sie 18-24 mer Oligonukleotide, die 70-110 bp Amplicons produzieren und die Primer mit kommerziellen Quellen synthetisieren. HINWEIS: Für jedes Gen von Interesse sollten zwei bis drei Primerpaare entworfen werden. Jeder Primer-Satz muss durch qPCR standardisiert werden. Die Vorwärts- und Reverse-Primer-Paare, die für das Gen CREB1 (Abbildung 4) verwendet wurden, sind unten: Primer-Set 1 Vorwärts: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAAGA-3' Rückseite: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3' Primer Set 2 Vorwärts: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3' Umgekehrt: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'</li>
		<li>Um den besten Primer auszuwählen, der für die nachgeschalteten Analysen verwendet werden soll, überwachen Sie den Ct-Wert und die Form der Amplifikationskurve in qPCR. HINWEIS: Primer, die Ct-Werte (Zyklusschwelle) zwischen 10-35 in der 40-Runden-Verstärkung und glatte Kurven während der exponentiellen Phase der PCR geben, gefolgt von einem glatten Plateau, sind optimal für Genexpressionsanalysen.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantitative Real Time PCR (qPCR): Hinweis: Verwenden Sie geeignete Rohre oder Platten, die mit der qPCR-Maschine kompatibel sind.<ol>
<li>CDNA mit nukleasefreiem Wasser auf 5x verdünnen.</li>
		<li>Fügen Sie auf 2 l verdünnte cDNA 8 l eines qPCR-Master-Mix hinzu, der 2 lH 2O, 5 l 2x SYBR Green Master-Mix und 1,0 l von 10 m (jeweils) vorwärts und rückwärts grundiert.</li>
		<li>Schließen Sie die Rohre und versiegeln Sie die Platte nach dem Pipetieren cDNA und Master-Mix. Mischen Sie den Inhalt durch sanftes Antippen und Abdrehen bei 1.500 U/min für 30 Sek.</li>
		<li>Fahren Sie mit der Einrichtung des qPCR-Computers fort.</li>
	</ol></li>
</ol>

Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Das Neuron R15 ist an der Regulierung von Herz-Kreislauf-, Verdauungs-, Atem- und Fortpflanzungssystemenbeteiligt 30. Eine regelmäßig rhythmische Berstaktivität des AP ist ein Merkmal von R15. Wie im Ergebnisbereich gezeigt, zeigen gepaarte Aufnahmen von R15 und L7, dass das Ganglienpräparat die Aktivität von R15-Neuronen erhalten hat. R15 und L7 Neuronen reagierten angemessen auf Ach. Diese Ganglienpräparation konnte bis zu 8-10 Stunden aufrechterhalten werden und die elektrophysiologische Aktivität ko...

Das menschliche Gehirn ist außerordentlich komplex mit fast 100 Milliarden Neuronen und Billionen synaptischer Verbindungen. Es gibt fast eine gleiche Anzahl von nicht-neuronalen Zellen, die mit Neuronen interagieren und ihre Funktion im Gehirn regulieren. Neuronen sind in Schaltkreise organisiert, die bestimmte Verhaltensweisen regulieren. Trotz der Fortschritte in unserem Verständnis von Gehirnfunktionen und neuronalen Schaltkreisen ist wenig über die Identität von Schaltkreiskomponenten bekannt, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Das Wissen um die Identitäten verschiedener Komponenten einer Schaltanlage wird unser Verständnis sowohl der zellulären als auch der molekularen Verhaltensgrundlagen und der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien für neuropsychiatrische Störungen erheblich erleichtern.
Die Meeresschnecke Aplysia californica war ein Arbeitspferd zur Bestimmung neuronaler Schaltkreise, die spezifischen Verhaltensweisen zugrunde liegen1-14. Das Aplysia Nervensystem enthält etwa 20.000 Neuronen, die in 9 verschiedene Ganglien organisiert sind. Die Neuronen von Aplysia sind groß und können leicht anhand ihrer Größe, elektrischen Eigenschaften und Position in den Ganglien identifiziert werden. Aplysia hat ein reiches Repertoire an Verhaltensweisen, die studiert werden können. Eines der gut untersuchten Verhaltensweisen ist der Kiemen-Entzugsreflex (GWR). Die zentralen Bestandteile dieses Reflexes befinden sich in Bauchganglien. Komponenten der GWR-Schaltung wurden kartiert und Beiträge verschiedener Komponenten ermittelt. Wichtig ist, dass GWR-Schaltungen assoziatives und nichtassoziatives Lernen durchlaufen5,6,15-19. Jahrzehntelange Studie über diesen Reflex haben auch mehrere Signalwege identifiziert, die eine Schlüsselrolle beim Lernen und Gedächtnis20-24haben.
Mehrere verschiedene Präparate von Aplysia wurden verwendet, um zelluläre und molekulare Grundlagen der Speicherspeicherung zu studieren. Dazu gehören das intakte Tier2,3, halbintakte Zubereitung1,7,13,14,16 und Rekonstitution von Hauptkomponenten der neuronalen Schaltung25-29. Hier wird eine reduzierte Vorbereitung auf die Erforschung von Aplysia-Ganglien für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen identifizierter neuronaler Schaltkreise beschrieben. Die folgenden vier identifizierten Neuronen wurden untersucht. R15, ein platzendes Neuron, L7 und L11, zwei verschiedene motorische Neuronen und R2, ein cholinerge Neuron wurden untersucht. R2 ist das größte Neuron, das im wirbellosen Nervensystem beschrieben wird. Kurz gesagt, beinhaltet diese Methode protease Behandlung von Ganglien, elektrophysiologische Messungen vor und nach pharmakologischen Behandlungen, und Isolierung von einzelnen Neuronen für die quantitative Analyse der Genexpression. Diese Methode ermöglicht es uns, molekulare Analysen mit gleichzeitiger Aufzeichnung von mehreren Neuronen zu kombinieren. Diese Methode wurde erfolgreich verwendet, um Reaktionen von R15 und L7 Neuronen auf Acetylcholin (Ach) durch gepaarte intrazelluläre Aufnahmen zu studieren. Nach elektrophysiologischen Messungen wurden R15 und L7 und andere identifizierte Neuronen wie L11 und R2 für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) der Expression von CREB1 isoliert, einem Transkriptionsfaktor, der für die Speicherspeicherung wichtig ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="372">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:120px;">Aplysia</td>
			<td style="width:123px;">National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 3014-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">P 9333-500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">C5080- 500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">BP 214-501</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">NaHCO4</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 6297-250G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">H 3375-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Protease</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:129px;">17105-042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Trizol</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:129px;">2194002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">ACROS</td>
			<td style="width:129px;">64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9515</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">3 M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9740</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9737</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM1751</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">qScript cDNA SuperMix</td>
			<td style="width:123px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">95048-100</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">4367659</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">11252-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:120px;">Stainless Steel Minutien Pins&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">26002-10 or</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:129px;">26002-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">Veriti Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">5430R Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">5430R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:120px;">Amplifier</td>
			<td>BRAMP-01R</td>
			<td style="width:129px;">NPI Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Digidata Converter</td>
			<td style="width:123px;">Instrutech ITC-18</td>
			<td style="width:129px;">HEKA ELEKTRONIK</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:123px;">Patch Star</td>
			<td style="width:129px;">Scientifica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

Eine große Herausforderung in der Neurobiologie besteht darin, die molekularen Grundlagen neuronaler Schaltkreise zu verstehen, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Sobald die spezifischen molekularen Mechanismen identifiziert sind, können neue therapeutische Strategien entwickelt werden, um Anomalien in bestimmten Verhaltensweisen zu behandeln, die durch degenerative Erkrankungen oder Alterung des Nervensystems verursacht werden. Die Meeresschnecke Aplysia californica eignet sich gut für die Untersuchungen der zellulären und molekularen Verhaltensgrundlagen, da neuronale Schaltkreise, die einem bestimmten Verhalten zugrunde liegen, leicht bestimmt und die einzelnen Komponenten der Schaltung leicht manipuliert werden könnten. Diese Vorteile der Aplysie haben zu mehreren grundlegenden Entdeckungen der Neurobiologie des Lernens und Gedächtnisses geführt. Hier beschreiben wir eine Vorbereitung des Aplysia-Nervensystems für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen. Kurz gesagt, Ganglien aus dem Nervensystem seziert wird Protease ausgesetzt, um die Ganglienscheide so zu entfernen, dass Neuronen exponiert sind, aber neuronale Aktivität wie bei dem intakten Tier behalten. Dieses Präparat wird verwendet, um elektrophysiologische Messungen von einzelnen oder mehreren Neuronen durchzuführen. Wichtig ist, dass die Neuronen nach der Aufzeichnung mit einer einfachen Methodik direkt aus den Ganglien für die Genexpressionsanalyse isoliert werden könnten. Diese Protokolle wurden verwendet, um gleichzeitige elektrophysiologische Aufnahmen von L7- und R15-Neuronen durchzuführen, ihre Reaktion auf Acetylcholin zu untersuchen und die Expression des CREB1-Gens in isolierten Einzel-L7-, L11-, R15- und R2-Neuronen von Aplysienzu quantisieren.

Die Gewichte der Tiere, die in dieser Studie verwendet wurden, reichten von 100-200 g. Nach den beschriebenen Protokollen führten wir elektrophysiologische Messungen und molekulare Analysen von Neuronen von Bauchganglien durch, die von Tieren im Bereich von 2-5 g bis 200-300 g isoliert wurden.
Die Standardisierung der Proteasebehandlung ist wichtig für erfolgreiche elektrophysiologische Messungen von Neuronen in den Ganglien. Zunächst wurden mehrere Protease-Konzentrationen (Dispase) und -d...

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Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Meeresschnecke Aplysia californica wurde weithin als neurobiologisches Modell für die Studien auf zellulärer und molekularer Basis des Verhaltens verwendet. Hier wird eine Methodik zur Erforschung des Nervensystems von Aplysia für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen identifizierter neuronischer Schaltkreise beschrieben.

Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

9.0K Aufrufe.  The Scripps Research Institute, Florida. Meeresschnecke Aplysia californica wurde weithin als neurobiologisches Modell für die Studien auf zellulärer und molekularer Basis des Verhaltens verwendet. Hier wird eine Methodik zur Erforschung des Nervensystems von Aplysia für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen identifizierter neuronischer Schaltkreise beschrieben.

Serie: Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

In-vitro-Assembly von Semi-künstliche molekulare Maschine und ihre Verwendung zum Nachweis von DNA-Schäden

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Forschung

Biotechnik

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

Molekulare Verschränkung und Electrospinnability von Biopolymeren

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

Zerkleinerte Gewebe in komprimierter Collagen: Ein zellhaltigen Biotransplant für einstufige rekonstruktive Reparatur

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Ein Markierungsfreie Technik für die Raum-zeitliche Imaging von Single Cell Sekrete

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we describe the preparation of polycrystalline silicon nanowire field-effect transistors (pSNWFETs) that serve as biosensing devices for biomarker detection. A protocol for chemical and biomolecular sensing by using pSNWFETs is presented. The pSNWFET device was demonstrated to be a promising transducer for real-time, label-free, and ultra-high-sensitivity biosensing applications. The source/drain channel conductivity of a pSNWFET is sensitive to changes in the environment around its silicon nanowire (SNW) surface. Thus, by immobilizing probes on the SNW surface, the pSNWFET can be used to detect various biotargets ranging from small molecules (dopamine) to macromolecules (DNA and proteins). Immobilizing a bioprobe on the SNW surface, which is a multistep procedure, is vital for determining the specificity of the biosensor. It is essential that every step of the immobilization procedure is correctly performed. We verified surface modifications by directly observing the shift in the electric properties of the pSNWFET following each modification step. Additionally, X-ray photoelectron spectroscopy was used to examine the surface composition following each modification. Finally, we demonstrated DNA sensing on the pSNWFET. This protocol provides step-by-step procedures for verifying bioprobe immobilization and subsequent DNA biosensing application.

We describe key steps for biosensing by using polysilicon nanowire field-effect transistors, including the preparation of the device and the immobilization and confirmation of a DNA molecular probe on the nanowire surface, as well as conditions for DNA sensing.

Herstellung von Silizium-Nanodraht-Feldeffekttransistor für chemische und Biosensorik Anwendungen

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Technik Molekulare Erkennung mit Bio-Mimetikum Polymers auf einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; however such coordinates must represent homologous structures across specimens. While many biological objects consist of easily identified landmarks to satisfy the assumption of homology, many lack such structures. One potential solution is to mathematically place semi-landmarks on an object that represent the same morphological region across specimens. Here, we illustrate a recently developed pipeline to mathematically define semi-landmarks from the mouse baculum (penis bone). Our methods should be applicable to a wide range of objects.

Many biological structures lack easily definable landmarks, making it difficult to apply modern morphometric methods. Here we illustrate methods to study the mouse baculum (a bone in the penis), including dissection and microCT scanning, followed by computational methods to define semi-landmarks that are used to quantify size and shape variation.

Sezierung, MicroCT Scanning und morphometrische Analysen der Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Vorbereitung, Reinigung und Anwendung von Fettsäure-haltigen Liposomen

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Auswertung photosynthetischer Verhaltensweisen durch gleichzeitige Messungen von Blattreflexion simultanen und Chlorophyllfluoreszenzanalysen

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...