Name: use of lysotracker to detect programmed cell death in embryos and differentiating embryonic stem cells
Uploaded: 2012-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Wir danken Mitglieder der Mariani Labor für Hilfe Bearbeitung des Protokolls. Diese Arbeit wurde durch einen CIRM Postdoctoral Training Grant (JLF), einem CIRM BRIDGES Praktikum (TZTT), der Robert E. und Mai R. Wright Foundation (FVM) und der University of Southern California (FVM) finanziert.

Ein. LysoTracker Färbung muriner Embryonen <ol><li> Generieren Maus-Embryonen, indem jungen (5-6 Wochen alt) Weibchen in Außengewindebolzen Käfigen. Überwachung am folgenden Morgen für das Auftreten eines Vaginaltampon anzeigt, dass das Zusammenfügen aufgetreten. Wenn die Frau schwanger ist, wird mittags an diesem Tag als 0,5 dpc (Tage nach Koitus). Das hier vorgestellte Verfahren ist ideal für Embryonen 7-13 dpc. </li><li> Auf der embryonalen Tag von Interesse, einschläfern den weiblichen nach anerkannten Protokollen und entfernen die Gebärmutter. Entfernen Sie die Embryos aus dem decidua in einer 10 cm-Petrischale mit Hanks BSS (ohne Phenolrot). Entfernen Sie die extra-embryonalen Membranen und müssen mindestens eine Spülung mit Hanks BSS auf fremde Gewebe und Blut zu entfernen. </li><li> Bereiten LysoTracker Embryo Färbelösung (5 mM LysoTracker in Hanks BSS). Eine angenehme Lautstärke für 1-2 Würfe beträgt 5 ml. Vorsichtig mischen, um den Farbstoff gleichmäßig auszuzahlen. </li><li> Fügen Embryonen in die LysoTracker Embryo Färbung SolutIonen in einem Mikrozentrifugenröhrchen oder Fläschchen und bei 37 ° C für 45 min. </li><li> Spülen Sie sehr vorsichtig in Hanks BSS viermal, jeweils 5 min waschen. </li><li> Fix in 4% Paraformaldehyd über Nacht. </li><li> Spülen Sie einmal in Hanks BSS, 10 min, um das Update zu entfernen. </li><li> Dehydratisieren durch eine Reihe Methanol (50%, 75%, 80%, 100%, 5 min pro Schritt) zu Hintergrundfärbung zu eliminieren. Dies ist zur Erzielung eines guten Signal-zu-Rauschen während der Bildgebung wichtig. </li><li> An dieser Stelle können Sie die Embryos Proben auf unbestimmte Zeit speichern in Methanol bei -20 ° C, vor Licht geschützt. </li></ol> Hinweis: Eine Gewebeprobe zu jeder Schritt für DNA Genotypisierung genommen werden kann, jedoch kann es am bequemsten, um eine Probe nur vor der Lagerung zu nehmen, so daß bis zu diesem Schritt sämtliche Proben kann chargenweise verarbeitet. Sammle eine Gewebeprobe aus dem Schwanz, Körper oder Kopf von jedem Embryo und legte alles in getrennten Röhren. Rehydrieren der Gewebeprobe und zur Vorbereitung genotyping. 2. LysoTracker Färbung von Differenzierung ES Kulturen <ol><li> Bereiten Embryoidkörpern über die Hanging Drop Methode 15 mit einem Startpreis Dichte von 500 Zellen pro 20 ul Tropfen. </li><li> Nach 3 Tagen, übertragen Sie die embryoid Gremien Suspensionskultur auf 10 cm nichthaftenden Petrischalen (dh diejenigen, für die bakteriologische Arbeit verwendet). Kultur für 5 Tage, Wechsel der Datenträger alle 2 Tage. </li><li> Am Tag 7, übertragen Sie die embryoid Gremien gelatinierte 8-well chamber slides (mit 0,1% Gelatine zu den Kammern, warten Sie 5 min, entfernen und hinzufügen, Medien). Übertragen 1-2 Embryoidkörpern pro Kammer. </li><li> Kultur für 10 Tage, wechselnden Medien jeden zweiten Tag. Seien Sie vorsichtig, um die Pipette an der Ecke der Kammer Rutsche so zu platzieren, um nicht stören die Embryoidkörper Befestigung an der Glasoberfläche. Auch wenn Zugabe von frischem Medien auch legen Sie die Pipette in die Ecke der Kammer und lassen die Medien langsam. </li><li> Nach 10 Tagen des Kultsure, die Apoptose als eine positive Kontrolle zu induzieren, behandeln einige der Wells mit 0,1 mM und 1,0 mM H 2 O 2 (fügen Sie den H 2 O 2 an die frische Medien, Mischung, dann zu den Zellen hinzu) für 60 min. Spülen zweimal mit D-PBS und Kultur über Nacht in regelmäßigen Medien. </li><li> Vorsichtig absaugen bestehenden Medien und fügen LysoTracker Zellfärbung Lösung (500 nM LysoTracker (Endkonzentration) in den Medien, 300 ul pro Kammer). </li><li> Bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Spülen zweimal mit D-PBS 2 mal, jeweils 5 min. </li><li> Fix in 4% Paraformaldehyd für 15 min bei RT. </li><li> Spülen zweimal mit D-PBS, 5 min. </li></ol> 3. Anzeigen LysoTracker Stained Embryos oder ES Kulturen <ol><li> Planen der Zellproben für die Mikroskopie durch Ansaugen des D-PBS; Entfernen der Kammer aus der Folie; Lufttrocknung für etwa 5 min, und dann Zugabe einer wässrigen Eindeckmedium (Vectashield mit DAPI oder ähnliches). Legen Sie eine Folienbarriere während drying zu verringern Bleichen des Fluorophors. Montieren Embryonen in einer tiefen Depression Glasschale oder kleine Petrischale in Vectashield oder ähnliches. </li><li> Visualisieren Sie mit einem sezieren oder zusammengesetzte Mikroskop mit einem Rhodamin oder Texas Red-Filter ausgestattet (LysoTracker RED DND-99, Anregung / Emission: 577/590 nm). Die Färbung ist in der Regel recht hell, so lange Belichtungszeiten sind in der Regel nicht erforderlich. </li></ol> 4. Die Quantifizierung der Ergebnisse mit bildgebenden Verfahren <ol><li> Machen Sie digitale Fotos von Ihren Proben unter den gleichen Expositionsbedingungen im manuellen Modus. </li><li> Öffnen Sie die Bilder in Adobe Photoshop oder einem ähnlichen Imaging-Programm. Um die Menge an LysoTracker Färbung zu bestimmen, auszuwählen und den roten Kanal Schwellenwert das Bild (wandelt das Bild in Schwarz-weiß), so dass die rote Färbung nunmehr durch weiße Pixel repräsentiert. Wählen Sie die weißen Pixel und verwenden Sie die Histogramm-Funktion, um die Gesamtzahl zu erhalten. </li><li> Verwenden Sie den blauen Kanal zu zählendie Anzahl von Kernen in dem Feld. Es kann nützlich sein, um eine Aufzeichnung der Anzahl von Annotation das Bild zu halten. </li><li> Notieren Sie die Werte und berechnen dann die durchschnittliche Färbung level pro Zelle. Wiederholen Sie diese Analyse mit dem gleichen Schwellenwert-Einstellung für alle Bilder, die Sie probieren. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Es ist ein normales Muster von PCD während der embryonalen Entwicklung, die sich ändern, wenn ein Wachstumsfaktor-Gen, wie etwa Sonic Hedgehog (Shh), 16,17 entfernt sind. Da LysoTracker ist ein kleines Molekül Farbstoff, hochdiffusiblen ist, kann die gesamte Embryo visualisiert werden, um Bereiche der PCD auch tief im Mesenchym 12,13 beurteilen Abbildung 1 zeigt die LysoTracker Färbemuster für normale und Shh -. / - Mutante Maus Embryonen 10.5dpc. - / - In diesem Stadium ist PCD stark Shh erhöhte mutanten Embryonen, insbesondere in den Gliedmaßen und Somiten regions. Abschnitte des Embryos kann ganz-Halterung bei stärkerer Vergrößerung (1B) abgebildet werden, um das Gesamtbild zu beurteilen. Seziert Abschnitte können auch geschnitten mit einem vibrierenden Mikrotom (1C) oder einem Kryostaten (DF) auf PCD Regionen näher zu offenbaren. TUNEL-Analyse wird am besten auf dünne Schnitte gemacht, wo die Penetration der terminalen Transferase ist weniger problematisch. LysoTracker Fleckenbildung und TUNEL-Assay kann in der gleichen Gewebe (1D-G) erfolgen. Diese Ergebnisse zeigen, dass, obwohl es keine strenge Korrelation zwischen 1.01 LysoTracker und TUNEL-Färbung, die allgemeinen Bereiche der PCD Überlappung erheblich. Bei einer höheren Vergrößerung, ist es möglich, puncta sehen, dass Fleck mit der TUNEL-Assay positiv, aber nicht mit dem LysoTracker Farbstoff, puncta, dass nur mit dem LysoTracker Farbschleier und puncta die überlappende Färbung. Wenn ein EB auf einem Gelatine-beschichteten Oberfläche plattiert ist, wird differenzierenden Zellen MIGRATe nach außen. Nach 10 Tagen der Kultur werden die Zellen in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Neuronen, Muskelzellen, und Kardiomyozyten differenziert haben. Die Kulturen in Abbildung 2 dargestellt enthalten gemischte Populationen dieser Zelltypen, aber man könnte passen unsere Protokoll zu studieren eines bestimmten Zelltyp von Interesse PCD. Zum Beispiel könnte der EB mit Retinsäure, die Differenzierung von Neuronen zu erweitern 19 behandelt werden, und dann die LysoTracker Assay verwendet werden, um neuronalen Zelltod unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten. Im normalen Kultur von ES-Zellen differenzierten, gibt es ein paar Zellen, PCD und durchlaufen diese können erkannt werden mit LysoTracker und / oder TUNEL-Assays (Abbildung 2A). PCD kann durch eine Reihe verschiedener Zytostatika wie Wasserstoffperoxid (H 2 O 2), die oxidative Schädigung induziert und initiiert den apoptotischen Weg 20,21 induziert werden. Eine geringe Dosis von H 2 O 2 erhöht sowohlLysoTracker und TUNEL-Färbung zu keiner Behandlung verglichen, während eine hohe Dosis führt Zellschrumpfung und weit verbreitete LysoTracker und TUNEL Positivität. Ähnlich zu den Ergebnissen im Embryo, ist es möglich, puncta sehen, dass Fleck mit der TUNEL-Assay positiv, aber nicht mit dem LysoTracker Farbstoff, puncta, dass nur mit dem LysoTracker Farbschleier und puncta die überlappende Färbung. Die Folge der Anwendung eines zytotoxischen Mittels, das Apoptose induziert wird Serumentzug Bedingungen, die Autophagie (2D) induzieren verglichen. Zellen, die einen Zeitraum von Serumentzug (1 Stunde) durchlaufen haben eine unterschiedliche Muster, wo LysoTracker und TUNEL-Färbung nicht hoch korrelieren. LysoTracker Färbung viel im Vergleich zu unbehandelten Kulturen erhöht, jedoch TUNEL Positivität ist auf normalem Niveau. Verwendung von Standard-Werkzeugen in Adobe Photoshop, können LysoTracker Färbung mit einem einfachen Schwellwertverfahren quantifiziert werdendas erlaubt es, die durchschnittliche Färbung Niveau für eine Population von Zellen zu berechnen. 3A-B zeigt, wie ein Beispiel-Bild während der Quantisierungsverfahren aussieht. Beginnend mit einem Ausgangsabbilds mit LysoTracker Färbung im roten Kanal und der DAPI-gefärbten Kernen in dem blauen Kanal (Panel 3A) wurde die roten Kanal dieses Bildes Schwellenwertvergleich um das Bild auf schwarz-weiß konvertieren und die weißen Pixel waren dann ausgewählt und gezählt (3A &#39;). A Thresholding Ebene wurde gewählt, dass repräsentiert die LysoTracker Färbemuster. Wie bei jedem Quantifizierungsmethode die Bilder verwendet, ist es wichtig, zu vermeiden Überbelichtung Ihre Fotos als dies möglicherweise in Überbetonung Differenzen ergeben. Die Zahl der Keime im Bereich kann dann durch suchen nur den blauen Kanal (3B) und Markieren der Kerne mit einem Zeichenwerkzeug wie einem Pinsel beim Zählen (3B &#39;) gezählt werden. Man kann dann exprimieren the Ebene der Färbung durch die Berechnung der durchschnittlichen Höhe der Färbung pro Zelle (Anzahl der Pixel / Kerne count). Will man diesen Algorithmus für Hochdurchsatz-Screening einsetzen, können die meisten Screening-Pakete Helligkeit in einem bestimmten Kanal zu messen und auch eine Objekt-ID-Funktion, wird Kerne in einem Feld zu zählen, aber für die meisten typischen Anwendungen ist die manuelle Methode ist schnell und einfach. Um ein Beispiel zu geben, wurde eine Probe Region aus den 2A-C quantifiziert und die Ergebnisse bestätigen, dass steigende Konzentrationen von H 2 O 2 zu einem höheren Maß an LysoTracker Färbung (3C). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. LysoTracker Färbung in normalen und Shh - / - Embryonen. A, A &#39;Normal und Shh -. / - Maus-Embryonen bei 10,5 dpc mit LysoTracker Red gefärbt, in Vectashield montiert und fotografiert unterein epiflourescence Seziermikroskop. Klammern geben die Lage der Vordergliedmaßen B, B &#39;Vorderbein von normalen und Shh -.. / - Embryonen bei höherer Vergrößerung abgebildet. Beachten Sie die normalen Domänen des Zelltods einschließlich der &quot;Posterior Necrotic Zone&quot; (mit einem Sternchen markiert) und einer Region, in der proximalen Mesenchym der Gliedmaßenknospe (mit einem Pfeil markiert). Shh null Gliedmaßen zeigen stärkere Färbung in der medialen und distalen Abschnitt . C, C &#39;. Medial Schnitte durch das Vorderbein Knospe sowohl normale als auch null Gliedmaßenknospen. Beachten Sie die Anwesenheit der Färbung in der proximalen Mesenchym (Pfeil) und AER (Pfeilspitze) des normalen Gliedmaßenknospe und starke Färbung innerhalb der dorsalen und ventralen und distalen Mesenchym im null Gliedmaßenknospe. DF. Das gleiche Abschnitt (12 micron, gefroren Abschnitt) wurde für LysoTracker und TUNEL-Färbung (Roche 1.684.795) abgebildet. Der Abschnitt durch den distalen Abschnitt des Shh null mesencHyme. Die Pfeilspitze zeigt auf der VRE. Beachten Sie, wie das allgemeine Muster sehr ähnlich ist mit beiden Methoden, aber die Färbung nicht vollständig überschneiden. G, G &#39;. Bei einer höheren Vergrößerung der VRE und Mesenchym, kann man sehen, sowohl das Vorhandensein von puncta die LysoTracker oder TUNEL-positiv sind nur so gut wie puncta die überlappende Färbung. <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. LysoTracker Färbung in differenzierten ES-Zellen. Differenzieren Zellen wurden auf 8-Kammer gleitet in der Abwesenheit von LIF ausplattiert. Um zu zeigen, wie LysoTracker und TUNEL-Färbung vergleichen, wurde der Apoptoseweg mit 2 unterschiedlichen Dosen an H 2 O 2 induziert wird, während die Autophagie induziert wurde unter Verwendung von 1 Stunde Serumentzug. Diese Bilder wurden mit einem Zeiss LSM5 Konfokalmikroskop AA-A&#39;&#39;:. Unbehandelte Kulturen zeigen einige normale Apoptose durch LysoT angegebenracker und TUNEL Färbung. Das Muster mit beiden Techniken meist überlappt (weiße Pfeile), jedoch kann man ein paar puncta die LysoTracker nur positiv (rote Pfeile) sind siehe B-B&#39;&#39;, CC &quot;:. Behandlung mit steigenden Mengen an H 2 O 2 stimuliert Apoptose . Die niedrigere Dosis zeigt mehr LysoTracker und TUNEL positive puncta, wenn zu unbehandelten Zellen verglichen. Die höhere Dosis induziert in noch mehr LysoTracker und TUNEL positive puncta. Weiß Pfeile weisen auf überlappende Färbung, während die roten Pfeile zeigen auf puncta, die positiv für LysoTracker nur. Es ist auch möglich, dass nur positive puncta für TUNEL-Färbung (grüne Pfeile) sind s. DD &quot;:. Serumentzug kann Autophagie induzieren, welche kann eine Materialanhäufung in Lysosomen und autophagolysosomes stimulieren. Beachten Sie, wie viele weitere LysoTracker puncta sichtbar sind im Vergleich zu unbehandelten Kulturen. TUNEL positive puncta vorhanden sind (von denen die meisten Überschneidungen LysoTracker Fleckention, weiße Pfeile), jedoch ist die Anzahl nicht stark erhöht, verglichen mit unbehandelten Bedingungen. Darüber hinaus unter Serumentzug Bedingungen sind LysoTracker nur positive puncta weit verbreitet (rote Pfeile). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Quantifizierungsverfahren um das Niveau der Färbung in einer Population von Zellen unter Verwendung von Adobe Photoshop beurteilen. A: Ein Teil von 2A wurde ausgewählt und die LysoTracker (roten Kanal) und DAPI-Färbung (Kerne, blauen Kanal) wird in dieser Tafel gezeigt A &#39;:. Die roten Kanal von 3A wurde Schwellenwertvergleich um es um eine Schwarz-Konvertierung Weiß-Bild. Die weißen Pixel können dann ausgewählt und gezählt werden unter Verwendung des Histogramms Funktion B-B &#39;:. Die blauen Kanal zeigt die Kerne und während sie zu zählen, das Bild kann mit einer Zeichnung erläuterten Funktion wie einem Pinsel C:. Dies ist ein Exreichlichen Quantifizierung einer Probe aus Paneelen 2A-C. Die Daten werden als Pixel pro Kerne vertreten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4254/4254fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wichtige Kennzeichen der Apoptose sind die Detektion von DNA-Schädigung mit der TUNEL-Assay, zusammen mit dem Nachweis von Caspase-Aktivität (detektiert mit mAbs oder eines bindenden Moleküls wie zVAD-fmk), die Beobachtung von zellulären Veränderungen, und die Präsentation von Phosphatidylserin (PS ) auf der Membranoberfläche (detektiert durch Annexin-V-Bindung). Es gibt einige Nachteile, die mit jedem dieser Assays. Zum Beispiel ist das Endgerät Transferase in der TUNEL-Assay verwendet wird, nicht mehr als ein ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td></td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> LysoTracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> # L-7528 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks BSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14025-076 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> EMD </td><td> EM-PX0055-3 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> VECTOR </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> Cellgro </td><td> 25-025-CI </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Cellgro </td><td> 25-000-CI </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.02 </td><td></td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> b-Mercaptoethanol, 50 mM </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> LabTek-II Chamber Slides (8-well) </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 154534 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1% Gelatine </td><td> Millipore </td><td> ES-006-B </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (D-PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lösung Rezepte 4% Paraformaldehyd Für 100 ml: <ol><li> Mix 4 g Paraformaldehyd, 90 ml H 2 O und NaOH (ein Tropfen 2N NaOH). Die Paraformaldehyd nicht in Lösung gehen, bis Sie fügte etwas NaOH haben, um den pH zu erhöhen. </li><li> Umrühren und Wärme bei 60 ° C, bis sich das Pulver vollständig in Lösung (~ 10-20 min). Nicht überhitzen. </li><li> Hinzufügen ~ 10 ml 10x PBS auf ein Endvolumen von 100 ml zu erreichen. </li><li> Lagerung bei -20 ° C in bequemer (~ 10 ml oder ~ 40 ml) Aliquots. </li></ol> WARNUNG: Paraformaldehyd in &#39;Halskrause&#39; Form (komprimiert kleinen Pellets) weniger Pulver und kann daher außerhalb der Haube gemessen werden. Allerdings sollten Sie tragen noch eine schützende Staubmaske (N95zumindest) während der Handhabung. EB Nährmedien Für 500 ml EB Media: <table border="1"><tbody><tr><td> DMEM: </td><td> 404,5 ml </td></tr><tr><td> FBS: </td><td> 75,0 ml </td></tr><tr><td> L-Glutamin: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol: </td><td> 500ul </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

use of lysotracker to detect programmed cell death in embryos and differentiating embryonic stem cells

Der programmierte Zelltod (PCD) bei Erwachsenen mit normalem Gewebe Homöostase und während der Embryonalentwicklung von Geweben und Organen 1,2,6,7 gestalten. Während der Entwicklung können giftige Chemikalien oder genetische Veränderungen zu einer erhöhten PCD oder ändern PCD-Muster, was zu Entwicklungsstörungen und Missbildungen 3-5. Um die Ätiologie dieser Defekte zu verstehen, kann die Studie von Embryonen mit in-vitro-Assays, die Differenzierung embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) verwendet ergänzt werden. Apoptose ist ein gut untersuchtes Form PCD die sowohl intrinsischen und extrinsischen Signalisierung an die Caspase Enzymkaskade aktivieren beinhaltet. Charakteristisch Zellveränderungen sind Membran blebbing, nukleare Schrumpfen und DNA-Fragmentierung. Andere Formen von PCD nicht verbunden Caspaseaktivierung und kann das Endergebnis der verlängerten Autophagie sein. Unabhängig von dem PCD-Weg, müssen sterbenden Zellen entfernt werden. Bei Erwachsenen, die Immunzellen perform diese Funktion, während in Embryonen, bei denen das Immunsystem ist noch nicht entwickelt, tritt Entfernung durch einen alternativen Mechanismus. Dieser Mechanismus beinhaltet benachbarten Zellen (so genannte &quot;nicht-professionellen Phagozyten&quot;) die Übernahme einer phagocytic Rollenspiel erkennen sie die &quot;eat me&quot;-Signal auf der Oberfläche des sterbenden Zelle und verschlingen es 8-10. Nach engulfment wird der Schmutz in den Lysosomen zum Abbau gebracht. Somit unabhängig von PCD-Mechanismus kann eine Erhöhung in lysosomalen Aktivität mit erhöhter Zelltod korreliert werden. Um PCD, eine einfache Assay Lysosomen in dicken Geweben und mehrschichtigen differenzierenden Kulturen visualisieren studieren können nützlich sein. LysoTracker Farbstoff ein hochlöslich kleines Molekül, das in saurer subzelluläre Kompartimente wie Lysosom 11-13 gehalten wird. Der Farbstoff wird durch Diffusion und durch den Verkehr gezogen. Da Penetration ist kein Hindernis, Visualisierung von PCD in dicke Gewebe und Multi-Layer-Kulturen möglich ist 12,13 </sup&gt;. Im Gegensatz dazu wird TUNEL (Terminal Desoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling) Analyse 14, um kleine Proben, histologischen Schnitten und Monoschichtkulturen begrenzt, da das Verfahren erfordert die Eingabe / Permeabilität einer terminalen Transferase. Im Gegensatz zu Anilinblau, die und diffundiert wird durch Lösungsmittel gelöst ist LysoTracker Red DND-99 fixierbar, hell und stabil. Färbung visualisiert werden können mit Standard-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie in whole-mount oder Abschnitt mit einem wässrigen oder lösemittelhaltigen Eindeckmittel 12,13. Hier beschreiben wir Protokolle mit diesen Farbstoff an PCD in Normal-und Sonic-Hedgehog null Maus-Embryonen zu suchen. Darüber hinaus zeigen wir, Analyse von PKD bei der Differenzierung von ES-Zellkulturen und präsentieren eine einfache Quantifizierung Methode. Zusammenfassend kann LysoTracker Färbung eine großartige Ergänzung zu anderen Methoden zur Erkennung PCD sein.

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Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Wir stellen eine einfache Protokoll zu Bereichen programmierten Zelltod (PCD) in Mausembryonen und Differenzieren embryonalen Stamm (ES)-Zellkulturen unter Verwendung eines gut löslichen Farbstoff genannt LysoTracker visualisieren.

Verwendung LysoTracker zum programmierten Zelltod in Embryonen Erkennen und Differenzieren embryonalen Stammzellen

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

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23.1K Aufrufe.  University of Southern California. Wir stellen eine einfache Protokoll zu Bereichen programmierten Zelltod (PCD) in Mausembryonen und Differenzieren embryonalen Stamm (ES)-Zellkulturen unter Verwendung eines gut löslichen Farbstoff genannt LysoTracker visualisieren.

Serie: Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biologie

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

Tracing Genexpression durch Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase in ganze Mausembryonen

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Neurowissenschaften

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

Zellliniengesteuerte Massenspektrometrie-Proteomik im sich entwickelnden (Frosch-)Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Chemie

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...