Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und einfache Methode, um primäre Melanozyten- und Fibroblastenkulturen von Mäusen zu erzeugen. Da diese Technik nicht erfordert, dass Epidermis und Dermis getrennt werden, kann sie schnell und konsistent mit minimalem Training durchgeführt werden. Diese Methode kann verwendet werden, um kutane Melanozyten- und Fibroblastenbiologie zu studieren.
Experimente in diesen Kulturen können Erkenntnisse liefern, die für Krebs, Wundheilung und Pigmentdefekte relevant sind. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass Sie alle notwendigen Reagenzien vorbereiten und die Temperatur des Wasserbades überprüfen. Wenn Sie mehrere Proben verarbeiten möchten, lesen Sie die Reagenzienskalierungsanleitung in Tabelle 1.
Dieser Prozess wird Brandon Murphy demonstrieren, ein Student aus meinem Labor. In einem laminaren Fließschrank den Kofferraum jeder eingeschläferten Maus kurz in eine sterile Petrischale mit 70% Ethanol rollen. Entfernen Sie die Maus aus dem Ethanol und legen Sie sie in eine leere sterile Petrischale.
Als nächstes sterilisieren Chirurgische Schere in 70%Ethanol. Verwenden Sie diese Schere, um einen Schnitt in der Haut auf der ventralen Seite des Rumpfes zu machen, beginnend vom Hals und weiter zum Schwanz. Mit sterilen Zangen, schälen Sie die Haut weg vom Rumpf der Maus, und entfernen Sie überschüssiges Fettgewebe von der dermalen Seite der Haut.
Legen Sie die Haut, Dermis Seite nach unten, in eine sechs Brunnenschale mit drei Millilitern 1X Antimykotiklösung. Bei Raumtemperatur zwei bis drei Minuten inkubieren. Schalten Sie dann den Tissue-Chopper ein und passen Sie die Einstellungen an die hier gezeigten einstellungen an.
Achten Sie darauf, vorsichtshalber zu sein, wenn Sie das Tissue-Chopper-Blatt installieren und die Maschine bedienen. Übertragen Sie die Haut, Dermis Seite nach unten, zu einem sterilen Gewebe Chopper Schale und passieren Sie die Haut vollständig durch den Gewebe-Chopper dreimal. Danach die homogenisierte Haut in eine sterile 15 Milliliter konische Röhre mit drei Milliliter hautverdauungspuffern.
Mischen Sie die resultierende Suspension mit einer P1000-Mikropipette 10 bis 15 Mal kräftig nach oben und unten. Kappen Sie die konische Röhre und inkubieren Sie die Probe in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten, um sicherzustellen, dass die Röhre alle drei bis fünf Minuten invertiert wird. Als nächstes zentrieren Sie das Rohr in einem schwingenden Schaufelrotor bei 750-fachm G bei Raumtemperatur für fünf Minuten, um die Zellen in der Haut homogenisieren zu lassen.
Verwenden Sie eine P1000 Mikropipette, um den Hautverdauungspuffer langsam und vollständig zu entfernen, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Achten Sie darauf, den gesamten Hautverdauungspuffer abzusaugen. Wenn Sie Probleme haben, waschen Sie das Zellpellet mit zwei bis drei Mils Melanozytenmedien und wiederholen Zentrifugation und entfernen Sie überschüssige Haut Verdauungspuffer.
Dann das Zellpellet in einem Milliliter Melanozytenmedien gründlich wieder aufhängen, indem man 15 bis 20 Mal mit einer P1000 Pipette nach oben und unten pfeift. Übertragen Sie die resultierende Zelllösung weise auf einen unbeschichteten Brunnen in einer sechs Brunnenschale, die einen Milliliter Melanozytenmedien enthält. Inkubieren Sie die beschichtete Haut in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 40 Minuten.
Danach übertragen Sie den Kulturüberstand von der unbeschichteten Schale auf einen Brunnen einer vorgewaschenen Kollagen-beschichteten sechs Brunnenschale. Fügen Sie G-418 zu den Medien hinzu, so dass die Endkonzentration 100 Nanogramm pro Milliliter beträgt. Fügen Sie zwei Milliliter Fibroblastenmedien zu einem Brunnen der unbeschichteten Schale hinzu, die jetzt anhantibe Fibroblasten enthält.
Inkubieren Sie beide Kulturen über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Nach 16 bis 24 Stunden Inkubation, separat die Medien und alle Trümmer aus jeder Kultur zu saugen. Waschen Sie jede Schale zweimal mit einem Milliliter PBS für jede Wäsche.
Fügen Sie dann zwei Milliliter frischer Melanozytenmedien in die Melanozytenkultur und fügen Sie der Fibroblastenkultur zwei Milliliter frischer Fibroblastenmedien hinzu. In dieser Studie werden Fibroblasten- und Melanozytenkulturen gleichzeitig aus derselben Hautprobe erzeugt. Wenn die homogenisierte Haut zum ersten Mal plattiert wird, erscheinen die Medien trüb.
Nach der Inkubation werden jedoch größere Zellkonglomerate und anhaftende Zellfibroblasten in der Schale sichtbar. Nicht haftende Zellen aus der Kultur werden auf eine kollagenbeschichtete Schale übertragen und mit G-418 behandelt. Fibroblasten, die von G-418 getötet wurden, werden in den nächsten fünf Tagen im Melanozytenkulturmedium schwimmend gesehen.
Nach vier bis fünf Tagen in der Kultur beginnen die vergoldeten Melanozyten einen dendritischen Phänotyp mit melanozytärem Granulat zu nehmen. Dieser Phänotyp bleibt beim Passieren bestehen, während Cluster von kontaminierenden Keratinozyten verloren gehen. Die Reinheit der resultierenden Melanozyten- und Fibroblastenkulturen wird durch Durchflusszytometrie bestätigt.
Die Expression des Melanozytenmarkers GP100 ist spezifisch für die Melanozytenkulturen, während der Fibroblastenmarker FSP1 ausschließlich in den primären Fibroblasten zu finden ist. Kontroll-C59-Keratinozytenzellen sind die einzigen Kulturen, die positiv für den Keratinozytenmarker K14 färben. Zusätzliche Analysen werden durchgeführt, um zu bestimmen, wie lange es dauert, angereicherte Melanozytenkulturen zu etablieren.
GP100 positive Zellen beginnen am tagvierten Tag zu erscheinen und nach 10 Tagen in der Kultur Zuspitzen zu erreichen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um schnell Melanozyten- und Fibroblastenkulturen für eine Vielzahl von in vitro und hochdurchsatzigen omischen Assays zu erzeugen.
