Wir möchten Dr. Evan Newell und Dr. Sean Bendall für Rückfragen danken. Wir möchten auch DVS Sciences und Dr. Sean Bendall für eine Probe der Multi-Lanthanoid-Polystyrol-Kügelchen danken. Wir sind dankbar für die Finanzierung von NIH 2 U19 AI057229.

Alle Zellproben für die CyTOF müssen fixiert und permeabilisiert werden. Dies ermöglicht eine größere Eintrag des Iridium-haltigen DNA-Interkalator, und verhindert auch, dass während der Zelllyse MilliQ Wasser waschen und Resuspension Schritte unmittelbar vor der Injektion in die Masse Cytometer. Ein. Start-up der Messe Cytometer <ol><li> Öffnen Sie die CyTOF Software-Programm. Wählen Sie Instrument Setup. Auf der Karte Cage Registerkarte in der rechten unteren Ecke und klicken Sie Heater &quot;ON&quot;-Taste. Einschalten der Heizung mindestens 15 min vor der gewünschten Zeit, um genügend Zeit für die Sprühkammer Mantels erlauben bis 200 ° C zu erreichen </li><li> Setzen Sie die weiße Norm-Ject 3 ml Spritze in die Spritzenpumpe mit einer frischen Spritze mit MilliQ Wasser gefüllt. </li><li> Reinigung Vernebler. BackFlush den Vernebler, indem die Spritze und Schlauch bis 5% Citranox 2-3 mal durch die beiden kleineren flüssigen Einführung Hafen und dem größeren Gaseinleitungsöffnung ziehen. Wiederholen Rückspülung mit MilliQ Wasser to Reste von Citranox. </li><li> Überprüfen Sie, um zu bestätigen, dass die Lichter auf der Vorderseite des CyTOF wie in Abbildung 1 leuchten. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> Abbildung 1. CyTOF Bedienfeld leuchtet vor der Inbetriebnahme. <ol start="5"><li> Öffnen Argongas Flaschenventil. Dies sollte die &quot;ARGON&quot; Licht an der Vorderseite zum Einschalten führen. </li><li> Befestigen Sie den Vernebler, um Make-up Gaseinlass. Lösen Sie das Make-up Gasschlauch Anschluss und entfernen Sie die schwarze Gummi-O-Ring und das weiße konische Stück Plastik. Beachten Sie den breiteren &quot;Knöchel&quot; auf der Gaseinleitungsöffnung Schaft des Verneblers. Legen Sie den Stecker auf der Gaseinleitungsöffnung. Setzen Sie die schwarze O-Ring über das Ende des Gases Port und zwingen den O-Ring an der breitere Teil des Hafens Stiel. Setzen Sie das weiße konische Kunststoff-Stück auf der Oberseite mit dem schmalen Ende wies darauf hin, und Schraube auf dem Make-up Gasschlauch. </li><li&gt; Befestigen Sie den Vernebler in den flüssigen Einführung Schlauch. Schieben Sie den kleinen Schlauch in die Öffnung am Ende des Zerstäubers. Es werden zwei Haltestellen, ähnlich fühlen, zu den Anschlägen auf einer Mikropipette sein. Drücken Sie zunächst, bis Sie leichten Widerstand treffen, das Ende des kleinen Schlauch sollte am Ende des geraden Abschnitts aus Glas sein. Zweitens drücken Sie stärker, um das Ende des geraden Abschnitts des Glases weitere Kraft in die Armatur, und ziehen Sie die Verschraubung zu versiegeln. Stecken Sie das Ende des Zerstäubers in die weiße Öffnung im Heizmantel. </li><li> Auf der RFG-Controller auf der Registerkarte Instrument Setup-Fenster, drücken Sie &quot;Start Plasma&quot;. Da der Zerstäuber bereits eingelegt ist, drücken Sie &quot;OK&quot;. Die Software wird auf dem Kühler drehen, beginnen die Strömung des Gases, und zünden ein Plasma. Der Detektor Spannung hochfahren. Es wird ein Pop-up-Fenster mit der Meldung &quot;Plasma Start-up-Sequenz wurde erfolgreich abgeschlossen&quot;, wenn Sie fertig sein; drücken Sie &quot;OK&quot;. New Lichter sollten auf der Vorderseite (Abbildung 2 </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> Abbildung 2. CyTOF Bedienfeld leuchtet nach Plasma und gezündet Start-up erfolgreich abgeschlossen. <ol start="9"><li> Einschalten Spritzenpumpe. In der oberen rechten Ecke, die grüne Taste &quot;Play&quot;-Taste, um die Spritze Pumpe zu starten und beginnen strömenden Flüssigkeit durch den Schlauch und Spritzen aus dem Zerstäuber. Die Standard-Spritze Einstellungen sind für 3 ml Wasser. Damit Probe durch die Probenschleife fließen muss der Spritzenpumpe periodisch geändert werden, wenn es nicht mehr genügend Wasser. Am oberen Rand des Bildschirms besteht ein Zähler angibt, wie viel Flüssigkeit aus der Spritze Pumpe geflossen ist. Die Spritzenpumpe wird gestoppt, wenn dieser Zähler &quot;3,000&quot; oder den Kolben erreicht trifft das Ende der Spritze. Beim Nachfüllen der Spritze, müssen Sie klicken Sie auf &quot;Stop&quot;, anstatt das blaue &quot;Pause&quot;-Taste, um den Zähler zurückzusetzen. </li></ol>e &quot;&gt; 2. Tägliche Kalibrierung der Messe Cytometer <ol><li> Die Masse Zytometer benötigt ca. 20 min, um eine heiße, stabiles Plasma vor der Kalibrierung zu erreichen. Der Zweck der Abstimmung Schritte ist es, das gewünschte Signal der Tm169 oder Tb159 zu maximieren und gleichzeitig &quot;Gd155&quot; (Oxid; La139 + O16)-Signal unter 3% des höheren Wertes. Klicken Sie auf die Akquisition Schaltfläche Einstellungen, um die Datenerfassung Einstellungen Fenster zu öffnen. In der Analyten Registerkarte, klicken Sie auf das Periodensystem, um das Isotop Auswahl zu öffnen. Wählen Sie die Isotope im DVS Sciences Tuning-Lösung in der Bedienungsanleitung aufgeführt sind, klicken Sie dann auf &quot;Speichern&quot;. </li><li> Klicken Sie auf die Isotope Per Lesen-Taste, um die Messe (n) Per Lesen öffnen. Wählen Sie &quot;Impulse Count&quot; und Skalieren der Y-Achse durch Eingabe einer neuen Nummer und drücken Sie &quot;Enter&quot;. </li><li> Füllen Sie einen grünen 1 ml Norm-Ject Spritze mit Tuning-Lösung. Drehen Sie den Sample-Anschluss Wahlschalter auf &quot;LOAD&quot;, injizieren 450 ul Tuning-Lösung, dann drehen Sie den Wahlhebel zu &quot;injizieren&quot;. In der Messe Registerkarte Kalibrierung des Data Acquisit<html> ion Fenster Einstellungen klicken Sie auf &quot;Ausführen&quot; zu überwachen, welche Massen werden durch fließt. Die linke Seite des Fensters geringer Masse, während die rechte Seite höher Masse. Anmerkung: Es wird schon Signale in der TOF 9400-9800 Region aufgrund Xenonisotope im Argongas (Abbildung 3). Warten Sie, bis Tuning-Lösung Isotopen erscheinen als Streifen in diesem Display (Abbildung 4) starten. </li></ol><img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> Abbildung 3. Massenkalibrierung Registerkarte angezeigt, der Hintergrundwerte für verschiedene Isotope nach dem Waschen und Wasser abspülen. Die Region rund um TOF 9400-9800 entspricht Xenon-Isotope in der Argon-Gas, und sollte immer vorhanden sein. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . 4 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. Massenkalibrierung Registerkarte angezeigt, der vertikale Streifen für verschiedene Isotope im DVS Tuning-Lösung. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <ol start="4"><li> Gehen Sie zurück zu der Messe (n) Per Lesefenster und die grüne Taste &quot;Play&quot;-Button in der linken oberen Ecke. Jedes Isotops in Schritt 2.1 ausgewählt wird von einem anderen farbigen Linie dargestellt. Die Standard-x-Achse ist &quot;Time&quot;, in sek. Überwachen Sie die Ebenen der verschiedenen Isotope, bis sie stabil sind. </li><li> Tuning des Stroms. Auf der Registerkarte Parameter des Data Acquisition Fenster, wählen Sie &quot;Current&quot; aus der Drop-Down-Menü. Lassen start = 0, finish = 10, Step-Wert = 0,5, Einschwingzeit = 200, und drücken Sie &quot;speichern&quot;. Klicken Sie wieder auf der Messe (n) Per Lesefenster und Hit spielen. Die x-Achse ist nun &quot;Current&quot;. Beachten Sie, wo die Signale der Isotope Peak (siehe Abbildung 5), und r<html> ecord. Unter dem DAC Kanäle Registerkarte Setup des Instruments Setup-Fenster, scrollen Sie auf &quot;Current&quot; und geben Sie diesen neuen Wert. Drücken Sie &quot;Stromistwert Set&quot;, dann &quot;speichern unter&quot;. </li></ol><img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> Abbildung 5. Aktuelle Tuning-Profil. <ol start="6"><li> Tuning der Make-up-Gas. Ändern Sie im Dropdown-Menü &quot;Make-up-Gas.&quot; Lassen start = 0,55, end = 0,95, Step-Wert = 0,05, Einschwingzeit = 200. Drücken Sie sparen. Zurück zur Messe (n) Per Lesefenster und Hit spielen. Die x-Achse ist nun &quot;Make-up-Gas&quot; Durchfluss. Aufzuzeichnen, wo die Signale der Isotope Peak. Beachten Sie die rasche Zunahme der &quot;Gd155&quot;-Signal am Ende (Abbildung 6). Zurück zur DAC Kanäle Registerkarte Setup unten scrollen, um &quot;Make-up-Gas&quot;, und geben Sie diesen neuen Wert. Drücken Sie &quot;Stromistwert Set&quot;, dann &quot;speichern unter&quot;. </li></ol>BBILDUNG 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg &quot;/&gt; Abbildung 6. Make-up-Gas Tuning-Profil. <ol start="7"><li> Aufzeichnungsverhältnis gewünschte Isotop vs Oxid. Machen Sie eine zweite 450 ul Injektion von Tuning-Lösung. Auf der Registerkarte Parameter, wählen Sie &quot;Time&quot; aus der Drop-down-Menü, lassen start = 0, end = 10, Schritt-Wert = 1, Einschwingzeit = 200. Drücken Sie auf &quot;Speichern&quot;. Hit &quot;Play&quot; in Mass (n) Per Lesefenster. Nachdem die Linien stabilisiert zu haben (Abbildung 7), verwenden Sie den Cursor auf den Wert in der oberen linken Boxen für Tm169 oder Tb159 (höherer Wert) lesen und auch die &quot;Gd155&quot; Wert (&lt;3% des höheren Wertes). Diese Werte können auch in einer Tuning-Datei für zukünftige Referenz gespeichert werden. </li></ol><img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> Abbildung 7. Messung der Tuning-Lösung Signalintensitäten nach Optimierung Strom-und Make-up-Gas. <ol start="8"><li> Reinigung von samschen Schleife. Inject 3 ml MilliQ Wasser durch die Probenschleife, gefolgt von 500 ul DVS Waschlösung. Überwachen Sie den Fortschritt der Reinigung durch Drücken von &quot;run&quot; in der Messe Register Kalibrierung. Waschen, bis die Intensität der Streifen (Abbildung 4) abzunehmen beginnt, dann folgen von 3 ml MilliQ Wasser und Monitor bis hinunter in den Hintergrund Ebenen (Abbildung 3). </li></ol> 3. Laufende Proben <ol><li> Öffnen Sie den Erwerb Fenster. Standardeinstellungen: Haben Analysis = On-The-Fly, Signal = Dual, Dual Count Kalibrierung = Daten zu analysieren. Noise Reduction ausgewählt ist. Jedes davon kann bei Bedarf geändert werden. Geben Sie den Dateinamen ein. Alle Dateien müssen auf die E :/ / Laufwerk gespeichert werden. </li><li> Einstellen Übernahme Verzögerungen. Es wird eine leichte Verzögerung bei der Registrierung von Ereignissen Zelle von etwa 30 sec aufgrund der Länge der Rohrleitung zwischen der Probenschleife und dem Zerstäuber sein. Daher ist die Summe der &quot;Erwerb delay&quot; und &quot;Detector stFähigkeit Verzögerung &quot;soll mindestens 30 sec betragen. Detector Stabilität Verzögerung sollte wenigstens 20 sec betragen. </li><li> Einstellen Datenerfassung Zeit. &quot;Acquisition time&quot; ist die Anzahl der Sekunden Sie möchten Ihr Beispiel auszuführen. Füllen des gesamten 450 ul Probenschleife erfordern würde 600 sec dauern. Es wird vorgeschlagen, daß 50 bis 100 sec zu dem Ende der Laufzeit hinzugefügt werden, um Probe zu minimieren Verschleppung. </li><li> Resuspension der Probe. Zur Minimierung Aufbau von Salzen in der Maschine wird vorgeschlagen, daß mindestens zwei Waschungen in MilliQ Wasser durchgeführt werden am Ende der Zelle Färbung, gefolgt von einer abschließenden Resuspension in MilliQ Wasser. Das Volumen der MilliQ-Wasser verwendet, um das Zellpellet in Abhängigkeit von der Anzahl von Zellen mit dem Sie angefangen und der Zelle Erholung nach der gesamten Färbeverfahrens wird resuspendieren. Ein guter Ausgangspunkt ist 10 6 (Start-) Zellen / ml. Nach der Resuspension durch ein Zellsieb filtern, um Aggregate zu entfernen. </li><li> Ausgehend Beispiel auszuführen. Geben Sie einen neuen Dateinamen für die aktuelle Probe.<html> Schalten Sie die Probenschleife Ventil &quot;LOAD&quot;, injizieren die Probe, wechseln Sie zurück zu &quot;injizieren&quot;, dann klicken Sie auf &quot;Run&quot; in der Akquisition Fenster. </li><li> Registrierung Zelle Veranstaltungen. Zellen werden in dem Snapshot-Fenster als horizontale Sammlungen von Markierungen in jeder vertikalen Isotop / Marker Kanal (8) dargestellt werden. Während die Masse Zytometer 1.000 Zellen / sec registrieren können, wird eine bessere Auflösung zwischen Zelle Ereignisse in der Regel bei 300-500 Zellen / sec erhalten. Dies entspricht einem Durchschnitt von ~ 1 Zelle / screen refresh. Es kann bis zu 30 Sekunden, bevor die Zelle Event Zähler beginnt zu klettern. Dies ist auf &quot;On-the-fly&quot; Datenverarbeitung; keine Zelle Event Informationen verloren gehen. </li></ol><img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> Abbildung 8. Acquisition Fenster während Probe läuft, zeigt horizontalen Reihen von Stellen entsprechend den Elementen mit drei separaten Zelle Ereignissen verbunden.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen. <ol start="7"><li> Qualität der Zelle Ereignisse. Beachten Sie alle Hintergrund-Streifen in jedes Isotop-Kanal sowie der Zelle Ereignisrate. Die Masse Zytometer erkennt eine &quot;Zelle Veranstaltung&quot; als eine gewisse Zunahme des Signals über dem Untergrund, so Hintergrundsignal aus freien Metall oder ungebundene Antikörper können die &quot;Zelle Event&quot; count ändern. Zusätzlich kann ausgeführt Zellen mit zu hoher Konzentration zu einer erhöhten Anzahl von Dublett Ereignisse. Hintergrund kann durch zusätzliche Wäschen oder mehr Zellverdünnung vermindert werden. Dubletts kann durch größere Zellverdünnung minimiert werden, auf Kosten eines erhöhten Laufzeit. </li><li> Finishing Probe Datenerfassung. Wenn die Erfassungszeit erreicht ist, wird die Datenerfassung beendet. Es wird ein wenig Verzögerung, bevor ein Pop-up-Fenster mit sein ein &quot;OK&quot;-Taste erscheint, wieder ist dies durch &quot;On-the-Fly&quot; Datenverarbeitung. Abtastmodus kann auch gestoppt Prémat werdenurely durch das Drücken der &quot;Stop&quot;-Taste. In diesem Fall werden alle Zellen bereits registrierten Ereignisse gezählt und in Ausgabedateien verarbeitet werden. </li><li> Injection von mindestens 500 ul MilliQ Wasser zwischen jeder Probe auch minimiert Probenverschleppung. </li></ol> 4. Reinigen des Geräts Nach dem Gebrauch <ol><li> Waschlösung. Nach der letzten Probe wird ausgeführt und die Probenschleife mit Wasser gespült, injizieren 450 ul Waschlösung in die Probenschleife. Überwachen Sie die Freisetzung von freiem Metall in der Messe Kalibrierung der Registerkarte Data Acquisition Fenster Einstellungen wie in Schritt 2,8 (Abb. 9). Wenn das freie Metall-Signal zu verringern beginnt, mit 3 ml MilliQ Wasser spülen und zu überwachen, bis Hintergrundwerte erreicht werden. </li></ol><img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> Abbildung 9. Massenkalibrierung Registerkarte Fenster, während der Post-run Reinigung mit DVS Waschlösung. Die vertikalen Streifen im TOF Region 9800-11000 sind Antikörper-Label Isotope aus der Maschine gereinigt werden. Die vertikalen Streifen rund TOF 11500 zu den beiden Ir Interkalator Isotopen entsprechen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . 5. Abschalten der Maschine <ol><li> In der RFG-Controller auf der Registerkarte Instrument Setup-Fenster, wählen Sie &quot;Stop Plasma&quot;. Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, wird es ein Pop-up-Fenster mit der Aufforderung, die Vernebler entfernen. Drücken Sie auf &quot;OK&quot;. In der Karte Cage Registerkarte schalten Sie die Heizung. Schließen Sie das Ventil auf der Argon-Versorgung. </li><li> Entfernen der Vernebler. Entfernen Sie den Vernebler aus der Sprühkammer durch vorsichtiges Ziehen nach hinten. Lösen Sie die Probe Einführung Schlauch aus Schritt 1,6 und legen beiseite. Lösen Sie das Make-up Gaseinleitung Verbindung zu leicht lösen, dann ziehen Sie den Vernebler aus. Verlassen die Armatur verschraubt reduziert die Chancen von lOsing den schwarzen Gummi-O-Ring und weiß konische Stück Plastik. </li><li> Reinigung Vernebler. BackFlush beide Ports der Vernebler mit 5% Citranox mit der Spritze und Schlauch wie in Schritt 1.3. Speichern Sie, bedeckt, in 5% Citranox bis zum nächsten Gebrauch. </li></ol>

<ol>
	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

Die Autoren arbeiten beide am Human Immune Überwachungszentrum, ein Service-Center an der Stanford University, die Nutzungsgebühren erhebt sich ausschließlich auf die Kosten von Assays, einschließlich Masse Zytometrie erholen.

In den letzten Jahrzehnten hat sich Fluoreszenz-Durchflusszytometrie war ein Arbeitstier Verfahren zur Analyse von einzelnen Zellen, sowohl in Bezug auf Oberflächen-Expression und funktionelle Assays. Allerdings hat die Fragen der spektralen Überlappung der Fluoreszenzfarbstoffe die Anzahl der gleichzeitigen Marker begrenzt. Während Experimente mit mehr als 12 gleichzeitige Marker gemeldet wurden, macht die Höhe der Entschädigung notwendigen dies technisch schwierig. Statt Fluorophore, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> CyTOF TM Masse Zytometer </td><td> DVS Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Waschlösung </td><td> DVS Sciences </td><td> 201071 </td><td> 0,05% Flusssäure in Wasser </td></tr><tr><td> Tuning-Lösung </td><td> DVS Sciences </td><td> 201072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, Spurenelemente Salpetersäure </td></tr><tr><td> Eu-haltigen Polystyrol-Kügelchen </td><td> DVS Sciences </td><td> 201073 </td><td> Enthält natürliche Überfluß Eu Isotopen; Perlen an rund 1 Mio. / ml geliefert </td></tr><tr><td> Multi-Lanthanoid-(La / Pr / Tb / Tm / Lu) - Polystyrol-Kügelchen </td><td> DVS Sciences </td><td> Noch nicht im Handel erhältlichen </td><td> Enthält natürliche Überfluß Isotope von börsennotierten Lanthaniden </td></tr><tr><td> Salpetersäure (konzentriert) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima Spur-Metall reinen ICP-MS Grade </td></tr><tr><td> Polystyrol mit rundem Boden Rohr mit Zell-Sieb cap-5mL </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> verwendet werden, um Zellproben vor der Injektion filtern </td></tr><tr><td> Norm-Ject Tuberkulin Spritze 1ml </td><td> Henke Sass Wolf </td><td> 4010-200V0 </td><td> silikonfrei, latexfrei </td></tr><tr><td> Norm-Ject Spritze-3 mL </td><td> Henke Sass Wolf </td><td> 4010.000V0 </td><td> silikonfrei, latexfrei </td></tr><tr><td> MilliQ Wasser </td><td></td><td></td><td> 18 M reines Wasser, darf nicht in Glas-oder Plastikflaschen, die mit handelsüblichen Waschmittel (wegen ihrer hohen Barium-present) gewaschen wurden gespeichert werden. </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> saures Reinigungsmittel </td></tr><tr><td> Argon-Gas </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% Ultra-hohe Reinheit </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

In den letzten Jahren hat die schnelle Analyse von Einzelzellen üblicherweise durchgeführt mittels Durchflusszytometrie und fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Allerdings ist das Problem der spektralen Überlappung von Fluorophor-Emissionen die Anzahl der gleichzeitigen Sonden begrenzt. Dagegen ist die neue Masse CyTOF Zytometer von DVS Sciences Paare eine Flüssigkeit einzellige Einführungssystem mit einem ICP-MS. 1 Anstatt Fluorophore werden chelatisierende Polymere enthaltenden hoch angereicherten Metall-Isotope an Antikörper oder andere spezifische Sonden gekoppelt. 2-5 Aufgrund der Metall-Reinheit und Massenauflösung der Masse Zytometer, gibt es keine &quot;spektrale Überlappung&quot; von benachbarten Isotope, und daher keine Notwendigkeit zur Kompensation Matrizen. Zusätzlich, aufgrund der Verwendung von Lanthanidmetallen, gibt es keine biologischen Hintergrund und damit kein Äquivalent Autofluoreszenz. Mit einer Masse Fenster Spanning Atommasse 103-203, theoretisch bis zu 100 Etiketten könnten gleichzeitig unterschieden werden. Gegenwärtig, Mehr als 35 Kanäle zur Verfügung mit dem Chelatisierungsreagenzien ab DVS Sciences, ermöglicht beispiellose Dissektion der immunologische Profil der Proben. 6-7 Nachteile sind die Masse Zytometrie strengen Notwendigkeit eines gesonderten Metallisotops pro Sonde (kein Äquivalent vorwärts oder side scatter), und die Tatsache, dass es ein zerstörungsfreies Verfahren (keine Möglichkeit der Sortierung Rückgewinnung) ist. Die aktuelle Konfiguration der Masse Zytometer hat auch eine Zellen-Übertragungsrate von nur ca. 25% und erfordern somit eine höhere Anzahl von Zellen-Eingang. Optimale tägliche Leistung der Masse Zytometer erfordert mehrere Schritte. Das grundlegende Ziel der Optimierung besteht darin, die gemessene Signalintensität der gewünschten Metall-Isotope (M) maximieren, bei gleichzeitiger Minimierung der Bildung von Oxiden (M 16), daß das M Signalintensität zu verringern und stören beliebiger Signal an M +16. Der erste Schritt ist, um sich aufzuwärmen das Gerät so ein heißer, stabile ICP Plasma hergestellt wurde. Zweitens müssen die Einstellungen für aktuelle und Make-up-Gas-Strömungsrate auf einer täglichen Basis optimiert werden. Während der Probenahme wird der maximale Zelle Ereignisrate von Detektor-Effizienz und die Verarbeitungsgeschwindigkeit zu 1000 Zellen / Sekunde begrenzt. Jedoch in Abhängigkeit von der Probe Qualität, eine langsamere Zelle Ereignisrate (300-500 Zellen / Sekunde) ist in der Regel wünschenswert, damit eine bessere Auflösung zwischen Zellen Ereignisse zu maximieren und somit intaktes Singuletts über Dubletts und Schutt. Schließlich trägt angemessene Reinigung der Maschine am Ende des Tages minimieren Hintergrundsignal durch freie Metall.

Nach dem obigen Protokoll sollte durchzuführen vier Dinge. Erstens wird damit ausreichende Aufwärmzeit für die Masse Zytometer erzeugen einen heißen, stabiles Plasma für optimales Signal und minimalen Oxidbildung. Zweitens ausreichendes Waschen der Masse Zytometer mit MilliQ Wasser und DVS Waschlösung (Abbildung 9) wird dazu beitragen, die Niveaus von Metall Adsorption an die Schläuche und andere Teile der Maschine und hilft, Hintergrund während Probenaufnahme reduzieren (Abb. 8).</stron...

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Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Die Schritte, die zur täglichen Abstimmung und Optimierung der Leistung einer CyTOF Masse Zytometer beschrieben. Kommentare zu optimalen Probenaufbereitung und Durchfluss werden diskutiert

Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.7K Aufrufe.  Stanford University. Die Schritte, die zur täglichen Abstimmung und Optimierung der Leistung einer CyTOF Masse Zytometer beschrieben. Kommentare zu optimalen Probenaufbereitung und Durchfluss werden diskutiert

Serie: Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Forschung

Biotechnik

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie und Fluoreszenz-Imaging Durchflusszytometrie auf einem Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imaging von biologischem Gewebe durch Desorption Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Probenvorbereitung Strategien für Massenspektrometrie Imaging von 3D-Zellkulturmodelle

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Isolierung von primären humanen Colon Tumorzellen von Surgical Gewebe und Kultivierung sie direkt auf weiche elastische Substrate für Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Protocol for Bioinspired Design: A Ground Sampler Based on Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, known as the Aristotle's lantern, is a compelling source of bioinspiration with an intricate network of musculature and calcareous teeth that can scrape, cut, chew food and bore holes into rocky substrates. We describe the bioinspiration process as including animal observation, specimen characterization, device fabrication and mechanism bioexploration. The last step of bioexploration allows for a deeper understanding of the initial biology. The design architecture of the Aristotle's lantern is analyzed with micro-computed tomography and individual teeth are examined with scanning electron microscopy to identify the microstructure. Bioinspired designs are fabricated with a 3D printer, assembled and tested to determine the most efficient lantern opening and closing mechanism. Teeth from the bioinspired lantern design are bioexplored via finite element analysis to explain from a mechanical perspective why keeled tooth structures evolved in the modern sea urchins we observed. This circular approach allows for new conclusions to be drawn from biology and nature.

A protocol for bioinspired design is described for a sampling device based on the jaws of a sea urchin. The bioinspiration process includes observing the sea urchins, characterizing the mouthpiece, 3D printing of the teeth and their assembly, and bioexploring the tooth structure.

Ein Protokoll für Bioinspirierte Entwurf: Ein Boden Sampler Basierend auf Seeigel Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Ganzkörper-Massenspektrometrie Imaging durch Infrarot-Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisations (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In higher eukaryotes, paralogous genes can mask a potential phenotype by compensating the loss of a gene, thus limiting the information that can be obtained from genetic studies relying on single gene knockouts. We have developed a novel, rapid cloning method for guide RNA (gRNA) concatemers in order to create multi-gene knockouts following a single round of transfection in mouse small intestinal organoids. Our strategy allows for the concatemerization of up to four individual gRNAs into a single vector by performing a single Golden Gate shuffling reaction with annealed gRNA oligos and a pre-designed retroviral vector. This allows either the simultaneous knockout of up to four different genes, or increased knockout efficiency following the targeting of one gene by multiple gRNAs. In this protocol, we show in detail how to efficiently clone multiple gRNAs into the retroviral CRISPR-concatemer vector and how to achieve highly efficient electroporation in intestinal organoids. As an example, we show that simultaneous knockout of two pairs of genes encoding negative regulators of the Wnt signaling pathway (Axin1/2 and Rnf43/Znrf3) renders intestinal organoids resistant to the withdrawal of key growth factors.

This protocol describes the steps for cloning multiple single guide RNAs into one guide RNA concatemer vector, which is of particular use in creating multi-gene knockouts using CRISPR/Cas9 technology. The generation of double knockouts in intestinal organoids is shown as a possible application of this method.

Ein Protokoll für mehrfache Gen-Knockout in Maus-Dünndarm-Organoiden mit einem CRISPR-Concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Gleichzeitige Quantifizierung ausgewählter Kynurenine, analysiert durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Methods Article

Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer