Diese Studie wurde vom National Institutes of Health Zuschüsse R01HL105826 und K02HL114749 (Dr. Sadayappan) und American Heart Association Midwest Stipendien finanziert werden; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) und 13POST14720024 (Dr. Govindan). Die Autoren danken der Unterstützung von Dr. Jimmy Page, Jill Clampit und Dr. John Hudson, MSD, für ihre ausgezeichnete technische und Literatur Unterstützung bei der Entwicklung des Assays.

1. Uniplex cMyBP-C Assay <ol><li> Am Tag vor dem Experiment, Mantel der 96er MSD bloßen Standard-Platte mit Capture-Antikörper. Für cMyBP-C, mit einem Volumen von 30 ul monoklonalen Maus-anti-cMyBP-C-Antikörper (Gelatine frei) in einer Konzentration von 5 g / ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Da das gut ist hydrophob, Pipette die Lösung in der unteren Ecke des Brunnens, dann tippen Sie auf die Seiten der Platte, um die Lösung über den gesamten gut verteilt. </li><li> Die Platte wird mit Abklebefolie abgedeckt und O / N bei 4 ° C ohne Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Capture-Antikörper-Lösung, indem die Lösung über einen Waschbecken und dann auf einem Stapel Papierhandtücher. Nicht-spezifische Bindung zu der Platte wird durch Zugabe von 150 ul einer 5% (w / v) Blocker-A (high-grade BSA) in PBS in jede Vertiefung blockiert. </li><li> Verschließen Sie die Platte und Inkubation für 1 h bei RT unter Schütteln bei 700 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Während der Sperrung Schritt, bereiten die Standards und sBeispiele. Machen Sie das Standard-Serie durch Verdünnen rekombinantes cMyBP-C-Protein-Fragment (Aminosäuren 1-271) zu einer Ausgangskonzentration von 2.000 ng / ml in 1% (w / v) Blocker A / PBS. Dann seriell um den Faktor 5 verdünnt in 1% (w / v) Blocker A / PBS. Insgesamt 7 Standards + 1 Rohling (1% (w / v) Blocker A / PBS allein) wurden verwendet. </li><li> Blocking-Lösung und waschen die Platte 3x mit 150 ul 0,05% (v / v) Tween-20/PBS. Jedes Mal, entfernen Sie die Waschlösung durch Umdrehen der Platte über einem Waschbecken. Nach dem dritten Waschschritt Flick energisch die Platte über ein Waschbecken und klopfen Sie die Platte mit Nachdruck auf einer Schicht von Papiertüchern, bis es vollständig trocken ist. Dies ist ein entscheidender Schritt, da Inkubationsvolumina klein sind und der verbleibende Waschlösung deutlich verdünnen die nächste Inkubation. </li><li> Je 25 ul Standards und Proben in die Vertiefungen. Verschließen Sie die Platte und Inkubation bei RT unter Schütteln bei 700 rpm für 1 Stunde. </li><li> Bereiten Sie die Detektions-Antikörper-Lösung bei 1 ug / ml in 1%-Blocker A / PBS. A custom gemacht cMyBP-C-Antikörper (Epitop Aminosäuren 2-14) mit MSD SULFO-TAG Kennzeichnung dient als Nachweis-Antikörper. Kits sind für SULFO-TAG Kennzeichnung vorhanden, so dass es ein relativ einfaches Verfahren, um jede Antikörper beschriften. </li><li> Wiederholen Sie den Waschschritt wie in Schritt 1.4 beschrieben. </li><li> In 25 ul Detektions-Antikörper-Lösung in jede Vertiefung, versiegeln Sie die Platte, und Inkubation bei RT für 1 h auf einem Schüttler bei 700 Umdrehungen pro Minute eingestellt. </li><li> Während der Inkubationszeit, laufen MSD Demo-Platte (Platte mit LED-Leuchten), um die ordnungsgemäße Funktion des Sector Imager und Software (siehe Reagenz Abschnitt) zu gewährleisten. Auch verdünnter die Lese-Puffer, die von MSD vorgesehen ist, durch Zugabe von 5 ml 4x Lese-Puffer auf 15 ml destilliertem Wasser. </li><li> Wiederholen Sie den Waschschritt wie in Schritt 1.4 beschrieben. </li><li> In 150 ul Lese-Puffer in jede Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette. Achten Sie darauf, um Luftblasen (reverse Pipettieren ist eine geeignete Methode) zu vermeiden. Nach Zugabe der Lese-Puffer, sofort scannen die Platte in der BrancheImager. </li></ol> 2. 3-Komplex cMyBP-C, CK-MB und cTnI Assay <ol><li> Ein 96-Loch-3-Komplex Platte und Verdünnungsmittel Lösungen auf RT vor Gebrauch ins Gleichgewicht. Diese Platte ist vorher mit Fänger-Antikörper für cMyBP-C, CK-MB und cTnI von MSD. </li><li> In 25 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS in jede Vertiefung. Tippen Sie auf die Seiten der Platte, um sicherzustellen, dass die gesamte Lösung gut bedeckt ist. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit Abklebefolie, legen Sie die Platte auf einem Schüttler, und schütteln bei 700 rpm für 30 min. </li><li> In der Zwischenzeit wird eine Verdünnungsreihe Einzelkalibrators hergestellt. Da jeder gut drei Fänger-Antikörper drei Kalibratoren müssen gemischt und seriell vor Gebrauch verdünnt. Verdünnen rekombinanten cMyBP-C, CK-MB (MSD) und cTnI (MSD) zusammen in 1% (w / v) Blocker A / PBS auf eine Probe mit 2,000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml zu erstellen CK- MB und 25 ng / ml cTnI (Probe A). </li><li> Eine endgültige Volumen von mindestens 100 ul wird für jeden Standard vorbereitet. Umrunden das Standard-Serie, seriell verdünnt die Proben um den Faktor 5. Verwenden Sie 25 ul der Probe A in 100 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS Probe B. Dann erstellen Sie verwenden 25 ul Probe B in 100 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS Probe C erstellen und so weiter. Humanes Serum-Proben von 16 Patienten mit MI und 16 Kontrollpersonen wurden verwendet, um cMyBP-C, CK-MB und cTnI zu messen. Diese Proben wurden verdünnt, 2x in 1% (w / v) Blocker A / PBS. </li><li> In 25 ul der Standards und verdünnten Proben auf die 25 ul bereits in den Vertiefungen der Platte 3-Komplex. Es ist wichtig, auch eine leere (nur Verdünnungsmittel). Um die Technik zu etablieren, werden die Proben in technischen dreifach geladen. Ansonsten sind Duplikate ausreichend. </li><li> Verschließen Sie die Platte wieder (Abklebefolie kann wiederverwendet werden) und Inkubation auf einem Schüttler (700 rpm) bei RT für 2 Stunden. </li><li> Kurz bevor die Inkubation abgeschlossen ist, wird der Nachweis-Antikörper-Lösung hergestellt. Das verwendete Verdünnungsmittel ist 1% (w / v) Blocker-A in PBS. Alle three Sulfo-markierten Nachweisantikörper gemeinsam in einer Endkonzentration von 1 ug / ml jeder verdünnten. Detektions-Antikörper sind in der Regel bei einer 50x stock Konzentration zur Verfügung gestellt. </li><li> Für eine vollständige 96-Well-Platte, ist 2.700 ul gesamten verdünnten Lösung benötigt (mit Pipettieren Fehler enthalten). In 54 ul jeder Detektionsantikörper zu 2.538 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS. </li><li> Nach 2 Stunden, entfernen Lösungen durch kräftiges Ausklopfen der Platte über einem Waschbecken. Waschen Sie die Wells 3x mit 150 ul von 0,05% Tween-20 in PBS. In 25 ul Detektions-Antikörper-Lösung in jede Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette, und die Seiten der Platte abgegriffen werden, um sicherzustellen, dass die gesamte Lösung gut bedeckt ist. </li><li> Verschließen Sie die Platte und Inkubation für 1 h unter Schütteln bei 700 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Während der Inkubationszeit, laufen MSD Demo-Platte (Platte mit LED-Leuchten), um die ordnungsgemäße Funktion des Sector Imager und Software zu gewährleisten. Auch verdünnter die Lese-Puffer, die von MSD vorgesehen ist, durch Zugabe von 5 ml 4x lesen-Puffer auf 15 ml destilliertem Wasser. </li><li> Wiederholen Sie den Waschschritt in Schritt 2.8 beschrieben. </li><li> In 150 ul Lese-Puffer in jede Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette. Luftblasen vermeiden ist entscheidend (reverse Pipettieren ist eine geeignete Methode). Nach Zugabe der Lese-Puffer, sofort scannen die Platte in der Branche Imager. </li></ol>

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	<li>Thygesen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third+universal+definition+of+myocardial+infarction.">Third universal definition of myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).</li><li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research.">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).</li><li>Thompson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+electrochemiluminescence+wash+and+no-wash+immunoassays+for+detection+of+serum+antibodies+to+smooth+Brucella+strains.">Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains.</a> Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).</li><li>Kingsmore, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+measurement:+technologies+and+applications+of+protein+and+antibody+arrays.">Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).</li><li>Altan, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-acting+tumor+necrosis+factor+alpha-binding+protein+demonstrates+activity+in+both+in+vitro+and+in+vivo+models+of+endometriosis.">A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).</li><li>Patel, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+cytokine+detection+in+acute+coronary+syndrome+reveals+up-regulation+of+interferon+gamma+and+interleukin-10+post+myocardial+infarction.">High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction.</a> Clin. 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S., Jarolim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+elevated+cardiac+troponin+levels.">How to interpret elevated cardiac troponin levels.</a> Circulation. 124, 2350-2354 (2011).</li><li>Govindan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C+is+a+potential+diagnostic+biomarker+for+myocardial+infarction.">Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).</li><li>Barefield, D., Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+function+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+in+health+and+disease.">Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).</li><li>Kuster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein+C+phosphorylation+in+cardiac+disease.">Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).</li><li>Sadayappan, S., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+redefining+its+structure+and+function.">Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function.</a> Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).</li><li>Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+a+potential+early-stage,+cardiac-specific+biomarker+of+ischemia-reperfusion+injury.">Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury.</a> Biomark Med. 6, 69-72 (2012).</li><li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid:+a+multicenter+study.">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li><li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases.">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li></ol>

Eine vollständige Patentanmeldung anhängig ist (mit der Seriennummer 13/464, 466, Pub Nr. US 2012/0282618 A1 und Datum:. 05.04.12), um die Risikofaktoren, die mit cMyBP-C Abbau und Freisetzung in die menschliche Körperflüssigkeit verbunden zu bestimmen und Quantifizieren des Niveaus von cMyBP-C in einer humanen Körperflüssigkeit.

In dieser Studie zeigen wir die Anwendbarkeit eines Multiplex-Immunoassay zum Nachweis von mehreren kardialen Biomarkern im Serum von Patienten. Dieses Verfahren hat zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISA. Zuerst wird in der ECL-Assay-Kit statt kolorimetrischen Nachweis verwendet. In ECL, stimuliert ein elektrisches Signal die lokale Produktion der gemessenen Eigenschaft (Licht), damit Entkopplung der Stimulation Ereignis aus dem Signal, das Hintergrund 14 reduziert. Dies ermöglicht eine hohe Em...

Die Messung von geringen Mengen an Protein in komplexen biologischen Proben, wie Serum, ist von wachsender Bedeutung für die klinische Behandlung der Patienten sowie der Grundlagenforschung. So ist ein Anstieg der Serumspiegel von kardialen Biomarkern wie Troponin I, in einer klinischen Umgebung, die mit akutem Myokardinfarkt (MI) 1. Um Proteine ​​im Serum zu erkennen, ist Standard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) die am häufigsten verwendete Technik, da sie hohe Empfindlichkeit aufweist und ermöglicht eine absolute Quantifizierung des Analyten. Jedoch erfordern herkömmliche ELISAs eine relativ große Menge der Probe (in der Regel 100 ul), haben einen hohen Hintergrundsignal in einigen biologischen Flüssigkeiten, und sind mit der Messung nur eines Analyten per ELISA 2 beschränkt. Kürzlich wurde ein neues Immunoassay-Technik vorgestellt, umgeht viele dieser Nachteile. Diese modifizierte Assay entwickelt von MSD verwendet electrochemiluminescausübt (ECL) zur Signalerfassung, die für einen sehr niedrigen Hintergrund und eine erhöhte Empfindlichkeit ermöglicht, so dass die Verwendung von kleinen Probenvolumina. Elektrochemilumineszenz ist der Reporter-Molekül Ruthenium (II) trisbipyridal, die den Nachweis-Antikörper gebunden basiert. Das Reportermolekül emittiert Licht bei 620 nm auf die elektrische Stimulation der Unterseite der Platte mit 96 Vertiefungen, die Kohlenstoff-Elektrode in ihnen 3 integriert ist. Auch durch die Verwendung Spotlackierung können mehrere Einfang-Antikörper in einer Vertiefung (bis 10 auf einer 96-Well-Platte) beschichtet, um für die gleichzeitige Quantifizierung von verschiedenen Proteinen in einer einzigen Probe 4. Diese Technik wurde kürzlich verwendet, um proinflammatorische Zytokin Profile im Serum 5,6 messen. Die Multiplex-Platten von MSD positiv auf andere Multiplex Assay-Plattformen 7 zu vergleichen. Mit MSD als primäre Assay-Plattform, wir weiterentwickelt eine maßgeschneiderte 3 komplexe Platte, dass ceine gleichzeitig auch den Grad der kardialen Myosinbindungsprotein-C (cMyBP-C), Creatin-Kinase-MB (CK-MB) und Troponin I (cTnI), und die Ergebnisse wurden mit Monoplex Detektion cMyBP-C verglichen. CK-MB und cTnI sind gut etablierte Biomarker für MI. Allerdings kann erhöht dieser Biomarker von Krankheiten außer MI verursacht werden, z. B. Myokarditis oder Nierenversagen 8. Dies spricht für die Zugabe von zusätzlichen Biomarker, um die Spezifität des MI Diagnose zu erhöhen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass cMyBP-C ist auch ein potentieller Biomarker für MI 9. cMyBP-C ist ein dickes Filament assoziierten Protein, das in das Herz, 10-12, aber nicht in Skelett-oder glatte Muskulatur exprimiert wird. Somit ist das erhöhte Niveau der cMyBP-C in das Kreislaufsystem ein spezifischer Indikator für Herzschäden 13. In dieser Studie verglichen wir Uniplex Erkennung cMyBP-C mit der Verwendung einer benutzerdefinierten 3-Plex Assay Serumspiegel messencMyBP-C, CK-MB und cTnI im Serum von Patienten mit MI. In Zukunft könnte diese Signatur Technik verwendet, um MI bei Patienten mit Brustschmerzen in der Notaufnahme diagnostizieren. Die Institution Review Board (IRB) der Loyola University Chicago genehmigten die Studie für den Einsatz von deidentified humanen Proben und die Verwendung des Immunoassays (LU # 20392).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R92TC-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R93BA-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-137180L</td>
			<td>For coating, antibody has to be gelatin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plates and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well standard plate</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>L15XA-3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>N452A-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermaSeal Sealing Film</td>
			<td>Life Science Products Inc.</td>
			<td>ST-3098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS 2/4 digital microtiter shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3208001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay

Biomarker werden immer wichtiger in der klinischen Entscheidungsfindung, sowie Grundlagenforschung. Diagnose Myokardinfarkt (MI) wird weitgehend durch Erfassen herz-spezifische Proteine ​​in Patienten Serum oder Plasma als Indikator einer Myokard-Schädigung zurückzuführen. Nachdem vor kurzem gezeigt, dass Herzmyosin Protein-C (cMyBP-C) im Serum nach MI erkennbar, haben wir es als möglicher Biomarker MI vorgeschlagen. Biomarker sind in der Regel mit herkömmlichen Sandwich-Enzym-linked Immunosorbent Assays nachgewiesen. Allerdings erfordert diese Technik eine große Probenvolumen hat einen kleinen dynamischen Bereich und kann nur ein Protein zu einem Zeitpunkt zu messen. Hier zeigen wir, ein Multiplex-Immunoassay, bei dem drei kardialen Proteine ​​gleichzeitig mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden. Messen cMyBP-C in Uniplex oder zusammen mit Creatin-Kinase MB und Troponin I zeigten eine vergleichbare Empfindlichkeit. Diese Technik nutzt die Meso-Skala Entdeckung(MSD) Verfahren zum Multiplexen in einer 96-Well-Platte mit Elektrochemilumineszenz zur Detektion kombiniert. Während nur geringe Probenvolumina benötigt werden, sind eine hohe Empfindlichkeit und einen großen dynamischen Bereich erreicht. Mit dieser Technik, maßen wir cMyBP-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I-Spiegel im Serum von 16 Patienten mit MI und verglichen die Ergebnisse mit 16 Kontrollpersonen. Wir konnten alle drei Marker in diesen Proben erkennen und fand alle drei Biomarker nach MI erhöht werden. Diese Technik ist daher geeignet für den empfindlichen Nachweis von kardialen Biomarkern im Serum.

Die Grundprinzipien und Workflow des 3-Komplex Assays sind in Abbildung 1 dargestellt, und die gesamte Workflow wird in Tabelle 1 beschrieben. Uniplex Assays arbeiten nach dem gleichen Prinzip der Ausnahme, dass der gesamte Boden ist gut mit einem Capture-Antikörper beschichtet. Signalerfassung durch ECL in dem ein elektrisches Signal an den Boden des Bohrlochs angelegt wird, durchgeführt. Dies wiederum löst eine lokale Erzeugung von Licht durch eine chemische Reaktion der Lese-Puffe...

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A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Messung von Biomarkern in komplexen biologischen Proben wird zunehmend Führung klinische Entscheidungsfindung. Wir beschreiben eine sehr empfindliche Methode, um gleichzeitig die Herzmyosin bindendes Protein-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I im Serum von Patienten mit Myokardinfarkt und gesunden Kontrollpersonen.

Eine empfindliche und spezifische Quantifizierung Methode zur Bestimmung der Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C durch Elektrochemilumineszenz Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

a-sensitive-specific-quantitation-method-for-determination-serum

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Aufrufe.  Loyola University Chicago. Messung von Biomarkern in komplexen biologischen Proben wird zunehmend Führung klinische Entscheidungsfindung. Wir beschreiben eine sehr empfindliche Methode, um gleichzeitig die Herzmyosin bindendes Protein-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I im Serum von Patienten mit Myokardinfarkt und gesunden Kontrollpersonen.

Serie: A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Forschung

Biologie

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within the brain, ascorbate acts in a neuroprotective and neuromodulatory manner that involves ascorbate cycling between neurons and vicinal astrocytes - a relationship that appears to be crucial for brain ascorbate homeostasis. Additionally, emerging evidence strongly suggests that ascorbate has a greatly expanded role in regulating cellular and systemic iron metabolism than is classically recognized. The increasing recognition of the integral role of ascorbate in normal and deregulated cellular and organismal physiology demands a range of medium-throughput and high-sensitivity analytic techniques that can be executed without the need for highly expensive specialist equipment. Here we provide explicit instructions for a medium-throughput, specific and relatively inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Ascorbate plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. Here we describe a medium-throughput, specific and inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Eine schnelle und spezifische Mikroplatten-Assay zur Bestimmung der Intra-und extrazelluläre Ascorbat in kultivierten Zellen

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

Verfahren und wichtige Optimierungsstrategien für eine automatisierte Kapillar elektrophoretischen basierende Immunoassay-Methode

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...