Diese Studie wurde vom National Institutes of Health Zuschüsse R01HL105826 und K02HL114749 (Dr. Sadayappan) und American Heart Association Midwest Stipendien finanziert werden; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) und 13POST14720024 (Dr. Govindan). Die Autoren danken der Unterstützung von Dr. Jimmy Page, Jill Clampit und Dr. John Hudson, MSD, für ihre ausgezeichnete technische und Literatur Unterstützung bei der Entwicklung des Assays.

1. Uniplex cMyBP-C Assay <ol><li> Am Tag vor dem Experiment, Mantel der 96er MSD bloßen Standard-Platte mit Capture-Antikörper. Für cMyBP-C, mit einem Volumen von 30 ul monoklonalen Maus-anti-cMyBP-C-Antikörper (Gelatine frei) in einer Konzentration von 5 g / ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Da das gut ist hydrophob, Pipette die Lösung in der unteren Ecke des Brunnens, dann tippen Sie auf die Seiten der Platte, um die Lösung über den gesamten gut verteilt. </li><li> Die Platte wird mit Abklebefolie abgedeckt und O / N bei 4 ° C ohne Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Capture-Antikörper-Lösung, indem die Lösung über einen Waschbecken und dann auf einem Stapel Papierhandtücher. Nicht-spezifische Bindung zu der Platte wird durch Zugabe von 150 ul einer 5% (w / v) Blocker-A (high-grade BSA) in PBS in jede Vertiefung blockiert. </li><li> Verschließen Sie die Platte und Inkubation für 1 h bei RT unter Schütteln bei 700 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Während der Sperrung Schritt, bereiten die Standards und sBeispiele. Machen Sie das Standard-Serie durch Verdünnen rekombinantes cMyBP-C-Protein-Fragment (Aminosäuren 1-271) zu einer Ausgangskonzentration von 2.000 ng / ml in 1% (w / v) Blocker A / PBS. Dann seriell um den Faktor 5 verdünnt in 1% (w / v) Blocker A / PBS. Insgesamt 7 Standards + 1 Rohling (1% (w / v) Blocker A / PBS allein) wurden verwendet. </li><li> Blocking-Lösung und waschen die Platte 3x mit 150 ul 0,05% (v / v) Tween-20/PBS. Jedes Mal, entfernen Sie die Waschlösung durch Umdrehen der Platte über einem Waschbecken. Nach dem dritten Waschschritt Flick energisch die Platte über ein Waschbecken und klopfen Sie die Platte mit Nachdruck auf einer Schicht von Papiertüchern, bis es vollständig trocken ist. Dies ist ein entscheidender Schritt, da Inkubationsvolumina klein sind und der verbleibende Waschlösung deutlich verdünnen die nächste Inkubation. </li><li> Je 25 ul Standards und Proben in die Vertiefungen. Verschließen Sie die Platte und Inkubation bei RT unter Schütteln bei 700 rpm für 1 Stunde. </li><li> Bereiten Sie die Detektions-Antikörper-Lösung bei 1 ug / ml in 1%-Blocker A / PBS. A custom gemacht cMyBP-C-Antikörper (Epitop Aminosäuren 2-14) mit MSD SULFO-TAG Kennzeichnung dient als Nachweis-Antikörper. Kits sind für SULFO-TAG Kennzeichnung vorhanden, so dass es ein relativ einfaches Verfahren, um jede Antikörper beschriften. </li><li> Wiederholen Sie den Waschschritt wie in Schritt 1.4 beschrieben. </li><li> In 25 ul Detektions-Antikörper-Lösung in jede Vertiefung, versiegeln Sie die Platte, und Inkubation bei RT für 1 h auf einem Schüttler bei 700 Umdrehungen pro Minute eingestellt. </li><li> Während der Inkubationszeit, laufen MSD Demo-Platte (Platte mit LED-Leuchten), um die ordnungsgemäße Funktion des Sector Imager und Software (siehe Reagenz Abschnitt) zu gewährleisten. Auch verdünnter die Lese-Puffer, die von MSD vorgesehen ist, durch Zugabe von 5 ml 4x Lese-Puffer auf 15 ml destilliertem Wasser. </li><li> Wiederholen Sie den Waschschritt wie in Schritt 1.4 beschrieben. </li><li> In 150 ul Lese-Puffer in jede Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette. Achten Sie darauf, um Luftblasen (reverse Pipettieren ist eine geeignete Methode) zu vermeiden. Nach Zugabe der Lese-Puffer, sofort scannen die Platte in der BrancheImager. </li></ol> 2. 3-Komplex cMyBP-C, CK-MB und cTnI Assay <ol><li> Ein 96-Loch-3-Komplex Platte und Verdünnungsmittel Lösungen auf RT vor Gebrauch ins Gleichgewicht. Diese Platte ist vorher mit Fänger-Antikörper für cMyBP-C, CK-MB und cTnI von MSD. </li><li> In 25 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS in jede Vertiefung. Tippen Sie auf die Seiten der Platte, um sicherzustellen, dass die gesamte Lösung gut bedeckt ist. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit Abklebefolie, legen Sie die Platte auf einem Schüttler, und schütteln bei 700 rpm für 30 min. </li><li> In der Zwischenzeit wird eine Verdünnungsreihe Einzelkalibrators hergestellt. Da jeder gut drei Fänger-Antikörper drei Kalibratoren müssen gemischt und seriell vor Gebrauch verdünnt. Verdünnen rekombinanten cMyBP-C, CK-MB (MSD) und cTnI (MSD) zusammen in 1% (w / v) Blocker A / PBS auf eine Probe mit 2,000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml zu erstellen CK- MB und 25 ng / ml cTnI (Probe A). </li><li> Eine endgültige Volumen von mindestens 100 ul wird für jeden Standard vorbereitet. Umrunden das Standard-Serie, seriell verdünnt die Proben um den Faktor 5. Verwenden Sie 25 ul der Probe A in 100 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS Probe B. Dann erstellen Sie verwenden 25 ul Probe B in 100 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS Probe C erstellen und so weiter. Humanes Serum-Proben von 16 Patienten mit MI und 16 Kontrollpersonen wurden verwendet, um cMyBP-C, CK-MB und cTnI zu messen. Diese Proben wurden verdünnt, 2x in 1% (w / v) Blocker A / PBS. </li><li> In 25 ul der Standards und verdünnten Proben auf die 25 ul bereits in den Vertiefungen der Platte 3-Komplex. Es ist wichtig, auch eine leere (nur Verdünnungsmittel). Um die Technik zu etablieren, werden die Proben in technischen dreifach geladen. Ansonsten sind Duplikate ausreichend. </li><li> Verschließen Sie die Platte wieder (Abklebefolie kann wiederverwendet werden) und Inkubation auf einem Schüttler (700 rpm) bei RT für 2 Stunden. </li><li> Kurz bevor die Inkubation abgeschlossen ist, wird der Nachweis-Antikörper-Lösung hergestellt. Das verwendete Verdünnungsmittel ist 1% (w / v) Blocker-A in PBS. Alle three Sulfo-markierten Nachweisantikörper gemeinsam in einer Endkonzentration von 1 ug / ml jeder verdünnten. Detektions-Antikörper sind in der Regel bei einer 50x stock Konzentration zur Verfügung gestellt. </li><li> Für eine vollständige 96-Well-Platte, ist 2.700 ul gesamten verdünnten Lösung benötigt (mit Pipettieren Fehler enthalten). In 54 ul jeder Detektionsantikörper zu 2.538 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS. </li><li> Nach 2 Stunden, entfernen Lösungen durch kräftiges Ausklopfen der Platte über einem Waschbecken. Waschen Sie die Wells 3x mit 150 ul von 0,05% Tween-20 in PBS. In 25 ul Detektions-Antikörper-Lösung in jede Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette, und die Seiten der Platte abgegriffen werden, um sicherzustellen, dass die gesamte Lösung gut bedeckt ist. </li><li> Verschließen Sie die Platte und Inkubation für 1 h unter Schütteln bei 700 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Während der Inkubationszeit, laufen MSD Demo-Platte (Platte mit LED-Leuchten), um die ordnungsgemäße Funktion des Sector Imager und Software zu gewährleisten. Auch verdünnter die Lese-Puffer, die von MSD vorgesehen ist, durch Zugabe von 5 ml 4x lesen-Puffer auf 15 ml destilliertem Wasser. </li><li> Wiederholen Sie den Waschschritt in Schritt 2.8 beschrieben. </li><li> In 150 ul Lese-Puffer in jede Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette. Luftblasen vermeiden ist entscheidend (reverse Pipettieren ist eine geeignete Methode). Nach Zugabe der Lese-Puffer, sofort scannen die Platte in der Branche Imager. </li></ol>

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	<li>Thygesen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third+universal+definition+of+myocardial+infarction.">Third universal definition of myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).</li><li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research.">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).</li><li>Thompson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+electrochemiluminescence+wash+and+no-wash+immunoassays+for+detection+of+serum+antibodies+to+smooth+Brucella+strains.">Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains.</a> Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).</li><li>Kingsmore, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+measurement:+technologies+and+applications+of+protein+and+antibody+arrays.">Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).</li><li>Altan, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-acting+tumor+necrosis+factor+alpha-binding+protein+demonstrates+activity+in+both+in+vitro+and+in+vivo+models+of+endometriosis.">A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).</li><li>Patel, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+cytokine+detection+in+acute+coronary+syndrome+reveals+up-regulation+of+interferon+gamma+and+interleukin-10+post+myocardial+infarction.">High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction.</a> Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).</li><li>Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiplex+immunoassay+platforms.">Comparison of multiplex immunoassay platforms.</a> Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).</li><li>Mahajan, V. S., Jarolim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+interpret+elevated+cardiac+troponin+levels.">How to interpret elevated cardiac troponin levels.</a> Circulation. 124, 2350-2354 (2011).</li><li>Govindan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C+is+a+potential+diagnostic+biomarker+for+myocardial+infarction.">Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).</li><li>Barefield, D., Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+function+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+in+health+and+disease.">Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).</li><li>Kuster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein+C+phosphorylation+in+cardiac+disease.">Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).</li><li>Sadayappan, S., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+redefining+its+structure+and+function.">Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function.</a> Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).</li><li>Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+a+potential+early-stage,+cardiac-specific+biomarker+of+ischemia-reperfusion+injury.">Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury.</a> Biomark Med. 6, 69-72 (2012).</li><li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid:+a+multicenter+study.">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li><li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases.">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li></ol>

Eine vollständige Patentanmeldung anhängig ist (mit der Seriennummer 13/464, 466, Pub Nr. US 2012/0282618 A1 und Datum:. 05.04.12), um die Risikofaktoren, die mit cMyBP-C Abbau und Freisetzung in die menschliche Körperflüssigkeit verbunden zu bestimmen und Quantifizieren des Niveaus von cMyBP-C in einer humanen Körperflüssigkeit.

In dieser Studie zeigen wir die Anwendbarkeit eines Multiplex-Immunoassay zum Nachweis von mehreren kardialen Biomarkern im Serum von Patienten. Dieses Verfahren hat zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISA. Zuerst wird in der ECL-Assay-Kit statt kolorimetrischen Nachweis verwendet. In ECL, stimuliert ein elektrisches Signal die lokale Produktion der gemessenen Eigenschaft (Licht), damit Entkopplung der Stimulation Ereignis aus dem Signal, das Hintergrund 14 reduziert. Dies ermöglicht eine hohe Em...

Die Messung von geringen Mengen an Protein in komplexen biologischen Proben, wie Serum, ist von wachsender Bedeutung für die klinische Behandlung der Patienten sowie der Grundlagenforschung. So ist ein Anstieg der Serumspiegel von kardialen Biomarkern wie Troponin I, in einer klinischen Umgebung, die mit akutem Myokardinfarkt (MI) 1. Um Proteine ​​im Serum zu erkennen, ist Standard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) die am häufigsten verwendete Technik, da sie hohe Empfindlichkeit aufweist und ermöglicht eine absolute Quantifizierung des Analyten. Jedoch erfordern herkömmliche ELISAs eine relativ große Menge der Probe (in der Regel 100 ul), haben einen hohen Hintergrundsignal in einigen biologischen Flüssigkeiten, und sind mit der Messung nur eines Analyten per ELISA 2 beschränkt. Kürzlich wurde ein neues Immunoassay-Technik vorgestellt, umgeht viele dieser Nachteile. Diese modifizierte Assay entwickelt von MSD verwendet electrochemiluminescausübt (ECL) zur Signalerfassung, die für einen sehr niedrigen Hintergrund und eine erhöhte Empfindlichkeit ermöglicht, so dass die Verwendung von kleinen Probenvolumina. Elektrochemilumineszenz ist der Reporter-Molekül Ruthenium (II) trisbipyridal, die den Nachweis-Antikörper gebunden basiert. Das Reportermolekül emittiert Licht bei 620 nm auf die elektrische Stimulation der Unterseite der Platte mit 96 Vertiefungen, die Kohlenstoff-Elektrode in ihnen 3 integriert ist. Auch durch die Verwendung Spotlackierung können mehrere Einfang-Antikörper in einer Vertiefung (bis 10 auf einer 96-Well-Platte) beschichtet, um für die gleichzeitige Quantifizierung von verschiedenen Proteinen in einer einzigen Probe 4. Diese Technik wurde kürzlich verwendet, um proinflammatorische Zytokin Profile im Serum 5,6 messen. Die Multiplex-Platten von MSD positiv auf andere Multiplex Assay-Plattformen 7 zu vergleichen. Mit MSD als primäre Assay-Plattform, wir weiterentwickelt eine maßgeschneiderte 3 komplexe Platte, dass ceine gleichzeitig auch den Grad der kardialen Myosinbindungsprotein-C (cMyBP-C), Creatin-Kinase-MB (CK-MB) und Troponin I (cTnI), und die Ergebnisse wurden mit Monoplex Detektion cMyBP-C verglichen. CK-MB und cTnI sind gut etablierte Biomarker für MI. Allerdings kann erhöht dieser Biomarker von Krankheiten außer MI verursacht werden, z. B. Myokarditis oder Nierenversagen 8. Dies spricht für die Zugabe von zusätzlichen Biomarker, um die Spezifität des MI Diagnose zu erhöhen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass cMyBP-C ist auch ein potentieller Biomarker für MI 9. cMyBP-C ist ein dickes Filament assoziierten Protein, das in das Herz, 10-12, aber nicht in Skelett-oder glatte Muskulatur exprimiert wird. Somit ist das erhöhte Niveau der cMyBP-C in das Kreislaufsystem ein spezifischer Indikator für Herzschäden 13. In dieser Studie verglichen wir Uniplex Erkennung cMyBP-C mit der Verwendung einer benutzerdefinierten 3-Plex Assay Serumspiegel messencMyBP-C, CK-MB und cTnI im Serum von Patienten mit MI. In Zukunft könnte diese Signatur Technik verwendet, um MI bei Patienten mit Brustschmerzen in der Notaufnahme diagnostizieren. Die Institution Review Board (IRB) der Loyola University Chicago genehmigten die Studie für den Einsatz von deidentified humanen Proben und die Verwendung des Immunoassays (LU # 20392).

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>R92TC-2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Acros</td><td>9005-64-5</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MSD Blocker A</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>R93BA-1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline, 10X</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399-4</td><td>Filter before use</td></tr><tr><td>Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-137180L</td><td>For coating, antibody has to be gelatin free</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Plates and Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Multi-Array 96-well standard plate</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>L15XA-3</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>N452A-1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ThermaSeal Sealing Film</td><td>Life Science Products Inc.</td><td>ST-3098</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MSD SECTOR Imager 2400A</td><td>Meso Scale Discovery</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MTS 2/4 digital microtiter shaker</td><td>IKA</td><td>3208001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay

Biomarker werden immer wichtiger in der klinischen Entscheidungsfindung, sowie Grundlagenforschung. Diagnose Myokardinfarkt (MI) wird weitgehend durch Erfassen herz-spezifische Proteine ​​in Patienten Serum oder Plasma als Indikator einer Myokard-Schädigung zurückzuführen. Nachdem vor kurzem gezeigt, dass Herzmyosin Protein-C (cMyBP-C) im Serum nach MI erkennbar, haben wir es als möglicher Biomarker MI vorgeschlagen. Biomarker sind in der Regel mit herkömmlichen Sandwich-Enzym-linked Immunosorbent Assays nachgewiesen. Allerdings erfordert diese Technik eine große Probenvolumen hat einen kleinen dynamischen Bereich und kann nur ein Protein zu einem Zeitpunkt zu messen. Hier zeigen wir, ein Multiplex-Immunoassay, bei dem drei kardialen Proteine ​​gleichzeitig mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden. Messen cMyBP-C in Uniplex oder zusammen mit Creatin-Kinase MB und Troponin I zeigten eine vergleichbare Empfindlichkeit. Diese Technik nutzt die Meso-Skala Entdeckung(MSD) Verfahren zum Multiplexen in einer 96-Well-Platte mit Elektrochemilumineszenz zur Detektion kombiniert. Während nur geringe Probenvolumina benötigt werden, sind eine hohe Empfindlichkeit und einen großen dynamischen Bereich erreicht. Mit dieser Technik, maßen wir cMyBP-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I-Spiegel im Serum von 16 Patienten mit MI und verglichen die Ergebnisse mit 16 Kontrollpersonen. Wir konnten alle drei Marker in diesen Proben erkennen und fand alle drei Biomarker nach MI erhöht werden. Diese Technik ist daher geeignet für den empfindlichen Nachweis von kardialen Biomarkern im Serum.

Die Grundprinzipien und Workflow des 3-Komplex Assays sind in Abbildung 1 dargestellt, und die gesamte Workflow wird in Tabelle 1 beschrieben. Uniplex Assays arbeiten nach dem gleichen Prinzip der Ausnahme, dass der gesamte Boden ist gut mit einem Capture-Antikörper beschichtet. Signalerfassung durch ECL in dem ein elektrisches Signal an den Boden des Bohrlochs angelegt wird, durchgeführt. Dies wiederum löst eine lokale Erzeugung von Licht durch eine chemische Reaktion der Lese-Puffe...

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A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Messung von Biomarkern in komplexen biologischen Proben wird zunehmend Führung klinische Entscheidungsfindung. Wir beschreiben eine sehr empfindliche Methode, um gleichzeitig die Herzmyosin bindendes Protein-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I im Serum von Patienten mit Myokardinfarkt und gesunden Kontrollpersonen.

Eine empfindliche und spezifische Quantifizierung Methode zur Bestimmung der Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C durch Elektrochemilumineszenz Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Aufrufe.  Loyola University Chicago. Messung von Biomarkern in komplexen biologischen Proben wird zunehmend Führung klinische Entscheidungsfindung. Wir beschreiben eine sehr empfindliche Methode, um gleichzeitig die Herzmyosin bindendes Protein-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I im Serum von Patienten mit Myokardinfarkt und gesunden Kontrollpersonen.

Serie: A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1. Although genetic disposition and exposition to toxic substances are known causes for this disease in about one third of the patients, the origin of DCM remains largely unclear. In a substantial number of these patients, autoantibodies against cardiac epitopes have been detected and are suspected to play a pivotal role in the onset and progression of the disease2,3. The importance of cardiac autoantibodies is underlined by a hemodynamic improvement observed in DCM patients after elimination of autoantibodies by immunoadsorption3-5. A variety of specific antigens have already been identified2,3 and antibodies against these targets may be detected by immunoassays. However, these assays cannot discriminate between stimulating (and therefore functionally effective) and blocking autoantibodies. There is increasing evidence that this distinction is crucial6,7. It can also be assumed that the targets for a number of cardiotropic antibodies are still unidentified and therefore cannot be detected by immunoassays. Therefore, we established a method for the detection of functionally active cardiotropic antibodies, independent of their respective antigen. The background for the method is the high homology usually observed for functional regions of cardiac proteins in between mammals8,9. This suggests that cardiac antibodies directed against human antigens will cross-react with non-human target cells, which allows testing of IgG from DCM patients on adult rat cardiomyocytes. Our method consists of 3 steps: first, IgG is isolated from patient plasma using sepharose coupled anti-IgG antibodies obtained from immunoadsorption columns (PlasmaSelect, Teterow, Germany). Second, adult cardiomyocytes are isolated by collagenase perfusion in a Langendorff perfusion apparatus using a protocol modified from previous works10,11. The obtained cardiomyocytes are attached to laminin-coated chambered coverglasses and stained with Fura-2, a calcium-selective fluorescent dye which can be easily brought into the cell to observe intracellular calcium (Ca2+) contents12. In the last step, the effect of patient IgG on the cell shortening and Ca2+ transients of field stimulated cardiomyocytes is monitored online using a commercial myocyte calcium and contractility monitoring system (IonOptix, Milton, MA, USA) connected to a standard inverse fluorescent microscope.

The presented method offers a way to detect functional effective cardiotropic autoantibodies in the plasma of patients with dilated cardiomyopathy, irrespective of the specific antigen, by analysing the impact of isolated patient immunoglobulin on cellular shortening and intracellular calcium transients in isolated rat cardiomyocytes.

Die Messung der Antikörper Auswirkungen auf zelluläre Funktion von isolierten Kardiomyozyten

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Medizin

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, this assay was used to analyze intrinsic levels of MeCP2 in mouse brain tissue and the uptake of TAT-MeCP2 in human dermal fibroblasts. The MeCP2-ECLIA produces highly accurate and reproducible measurements with low intra- and inter-assay error. In summary, we developed a quantitative method for the evaluation of MeCP2 protein variants that can be utilized in high-throughput screens.

The electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) is a novel approach for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants, which produces highly quantitative, accurate and reproducible measurements with low intra- and inter-assay error over a wide working range. Here, the protocol for the MeCP2-ECLIA in a 96-well format is described.

Ein Electrochemilumineszenz-basierter Assay für MeCP2-Proteinvarianten

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Biochemie

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular isoform of the myosin regulatory light chain (MLC2v). MLC2v phosphorylation levels are significantly reduced in failing hearts, indicating the clinical importance of assessing the activity of cMLCK and the phosphorylation level of MLC2v to elucidate the pathogenesis of heart failure. This paper describes nonradioactive methods to assess both the activity of cMLCK and MLC2v phosphorylation levels. In vitro kinase reactions are performed using recombinant cMLCK with recombinant calmodulin and MLC2v in the presence of ATP and calcium at 25 &#176;C, which are followed by either a bioluminescent ADP detection assay or a phosphate-affinity SDS-PAGE. In the representative study, the bioluminescent ADP detection assay showed a strict linear increase of the signal at cMLCK concentrations between 1.25 nM to 25 nM. Phosphate-affinity SDS-PAGE also showed a linear increase of phosphorylated MLC2v in the same cMLCK concentration range. Next, the time-dependency of the reactions was examined at the concentration of 5 nM cMLCK. A bioluminescent ADP detection assay showed a linear increase in the signal during 90 min of the reaction. Similarly, phosphate-affinity SDS-PAGE showed a time-dependent increase of phosphorylated MLC2v. The biochemical parameters of cMLCK for MLC2v were determined by a Michaelis-Menten plot using the bioluminescent ADP detection assay. The Vmax was 1.65 &#177; 0.10 mol/min/mol kinase and the average Km was around 0.5 USA &#181;M at 25 &#176;C. Next, the activity of wild type and the dilated cardiomyopathy-associated p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK were measured. The bioluminescent ADP detection assay and phosphate-affinity SDS-PAGE correctly detected defects in cMLCK activity and MLC2v phosphorylation, respectively. In conclusion, a combination of the bioluminescent ADP detection assay and the phosphate-affinity SDS-PAGE is a simple, accurate, safe, low-cost, and flexible method to measure cMLCK activity and the phosphorylation level of MLC2v.

This study describes protocols for nonradiometric methods, a bioluminescent ADP detection assay and a phosphate-affinity SDS-PAGE, to determine the kinase activity of cardiac myosin light chain kinase (cMLCK) and the phosphorylation level of its substrate, myosin regulatory light chain (MLC2v).

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Elektrochemische) Verfahren zur Mykotoxin-Erkennung

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Biologie

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor analytes against the background of human serum are crucial.
Nanoimprinting lithography (NIL) was used to fabricate, at a low cost, sensing areas as large as 1.5 mm x 1.5 mm. The sensing surface was made of high-fidelity arrays of nanoholes, each with an area of about 140 nm2. The great reproducibility of NIL made it possible to employ a one-chip, one-measurement strategy on 12 individually manufactured surfaces, with minimal chip-to-chip variation. These nanoimprinted localized surface plasmon resonance (LSPR) chips were extensively tested on their ability to reliably measure a bioanalyte at concentrations varying from 2.5 to 75 ng/mL amidst the background of a complex biofluid-in this case, human serum. The high fidelity of NIL enables the generation of large sensing areas, which in turn eliminates the need for a microscope, as this biosensor can be easily interfaced with a commonly available laboratory light source. These biosensors can detect cardiac troponin in serum with a high sensitivity, at a limit of detection (LOD) of 0.55 ng/mL, which is clinically relevant. They also show low chip-to-chip variance (due to the high quality of the fabrication process). The results are commensurable with widely used enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based assays, but the technique retains the advantages of an LSPR-based sensing platform (i.e., amenability to miniaturization and multiplexing, making it more feasible for POC applications).

This work describes a nanoimprinting lithography method to fabricate high-quality sensing arrays that work on the principle of extraordinary optical transmission. The biosensor is low-cost, robust, easy to use, and can detect cardiac troponin I in serum at clinically relevant concentrations (99th percentile cutoff &#8764;10-400 pg/mL, depending on the assay).

Verwendung von außergewöhnlichen optischen Übertragung kardiale Biomarker in humanem Serum quantifizieren

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Biotechnik

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

Electrochemiluminescence-Assays für menschliche Insel-Autoantikörper

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

Digitale PCR zur Quantifizierung der zirkulierenden MicroRNAs in akuten Myokardinfarkt und kardiovaskulären Erkrankungen

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Detection of Human Islet Autoantibodies Using an Electrochemiluminescence Assay

Source: Gu, Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57227">Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2018)
This video showcases the electrochemiluminescence detection of islet autoantibodies in human serum. The antibodies in the serum bridge the ruthenium-conjugated antigen to the biotinylated capture antigen, forming complexes that are detected by electrochemiluminescence measurements.

Nachweis von humanen Insel-Autoantikörpern mittels eines Elektrochemilumineszenz-Assays

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Buffer Preparation

	Labeling ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Electrochemiluminescence Assay for Quantification of Target Protein Levels in Brain Lysate

Source: Steinkellner, H., et al., <a href="https://app.jove.com/v/61054">An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants.</a> J. Vis. Exp. (2020).
In this video, we demonstrate the electrochemiluminescence immunoassay for the quantitation of target protein levels in different samples. This assay is based on the luminescence produced in the electrochemical reaction. The intensity of light emitted is proportional to the quantity of the target protein in the sample.

Elektrochemilumineszenz-Assay zur Quantifizierung der Zielproteinspiegel im Gehirnlysat

Source: Steinkellner, H., et al., An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants. J. Vis. Exp. (2020).
In this video, we demonstrate ...