Unser PLA-Protokoll ermöglicht es, endogene Wechselwirkungen zwischen Proteinen an Membrankontaktstellen zu identifizieren und zu quantifizieren. Wir haben es verwendet, um die Interaktion zwischen zwei endoplasmatischen Retikulumproteinen an den mitochondrialen Kontaktstellen des endoplasmatischen Retikulums zu untersuchen. Diese Technik kombiniert PLA mit Organellenfärbungen und der Analyse der Organellenabstände.
Es ermöglicht die Lokalisierung und Quantifizierung der Interaktion zwischen Proteinen an den Kontaktstellen der Membranen zwischen Organellen. Nachdem Sie den Proximity-Ligations-Assay (PLA) und die Bildaufnahme durchgeführt haben, richten Sie die Zellanalysesoftware so ein, dass MATLAB gestartet und eine Erweiterung gestartet wird, indem Sie im Mac-Betriebssystem auf die Option Imaris oder in Windows auf das Menü "Bearbeiten" klicken. Wählen Sie die Voreinstellungen aus, wechseln Sie zum Bedienfeld "Benutzerdefinierte Werkzeuge" und legen Sie den Pfad fest.
Um die Bilder in die Software zu importieren, konvertieren Sie die konfokalen Stapelbilder in eine IMS-Datei, entweder direkt über die Arena-Sektion oder mit dem eigenständigen Dateikonverter, der eine Batch-Konvertierung ermöglicht. Klicken Sie nach dem Import auf Bearbeiten, gehen Sie zu Bildeigenschaften und wählen Sie Bildgeometrie aus, um die Bildkalibrierung zu überprüfen. Vergewissern Sie sich, dass die Voxelgröße mit der Pixelgröße übereinstimmt, die für das tatsächliche Bild in X und Y erwartet wird, und wählen Sie den Schritt, den das Mikroskop anwendet, um den Z-Stapel in Z.To anzupassen Klicken Sie im Menü auf Bearbeiten, gehen Sie zur Anzeigeanpassung und wählen Sie Anzeigeanpassung anzeigen.
Passen Sie jeden Kanal unabhängig voneinander an, um die Anzeige der einzelnen Farben zu optimieren. Dieser Schritt ist unerlässlich, um präzise Schwellenwerte festzulegen oder schwache Objekte zu erkennen. Klicken Sie dann auf "Bearbeiten" und wählen Sie "3D zuschneiden", um die Analyse auf eine einzelne Zelle zu beschränken, indem Sie das Bild zuschneiden.
Um eine andere Zelle im selben Sichtfeld zu analysieren, öffnen Sie dasselbe Bild erneut und schneiden Sie es anders zu. Erkennen Sie die PLA-Signale, die an der Stelle der ORP5- und ORP8-Interaktion erzeugt werden, indem Sie auf die Option "Neue Spots hinzufügen" klicken, wodurch ein neuer Satz von Objekten erstellt und der Spot-Erkennungsassistent geöffnet wird. Wählen Sie den Kanal aus, auf dem die Spot-Erkennung durchgeführt werden soll.
Passen Sie den geschätzten XY-Durchmesser an, damit der Spot-Erkennungsalgorithmus die gewünschten Objekte finden kann. Wenn der gewählte Wert zu hoch ist, verschmelzen die Objekte in der Nähe, und wenn der Wert zu klein ist, können abweichende Signale erkannt werden. Klicken Sie nun auf Hintergrundsubtraktion, um den Bildhintergrund vor der Spot-Erkennung zu entfernen und den lokalen Kontrast um die Objekte von Interesse zu verstärken.
Passen Sie den Schwellenwert für die Spot-Erkennung an, indem Sie die Qualität als Schwellenwert im automatischen Schwellenwert der Software beibehalten, oder ändern Sie diesen Wert geringfügig, um alle Objekte zu erkennen. Sobald die Spot-Erkennung abgeschlossen ist, speichern Sie die Erkennungsparameter und verwenden Sie sie wieder, um andere Bilder zu verarbeiten. Erkennen Sie dann das mitochondriale Netzwerk, um ein Oberflächen-Rendering zu generieren, indem Sie auf Neue Oberflächen hinzufügen klicken, um ein neues Objekt zu erstellen, und den Oberflächenerkennungsassistenten öffnen.
Wählen Sie den Kanal aus, auf dem die Flächenerstellung durchgeführt werden soll. Wenden Sie den Gauß-Filter an, um eine glattere Oberfläche zu erhalten, indem Sie auf das Kontrollkästchen "Glatt" klicken und einen Schwellenwert festlegen, der die kleinen Details angibt, die auf der Oberfläche beobachtbar sind. Führen Sie anschließend eine Hintergrundsubtraktion durch, um die lokalen Kontraste zu verstärken, und passen Sie den Schwellenwert an, um das mitochondriale Netzwerk basierend auf der Intensität des Signals zu erkennen.
Wenden Sie einen Filter auf die Oberfläche an, um kleine Residuen aus dem Schwellenwert zu entfernen, indem Sie die Anzahl der Voxel-Filter im Fenster "Oberfläche klassifizieren" auswählen, und spielen Sie mit den oberen und unteren Schwellenwerten, um nur die Objekte von Interesse beizubehalten. Sobald die Oberflächenerstellung abgeschlossen ist, speichern Sie die Erstellungsparameter und verwenden Sie sie wieder, um andere Bilder zu verarbeiten. Um eine Entfernungskarte außerhalb der erstellten Mitochondrienoberfläche zu erstellen, wählen Sie die Mitochondrienoberfläche im Szenenbaumfeld aus.
Klicken Sie auf Bildverarbeitung und wählen Sie die Oberflächenfunktion aus, gefolgt von der Abstandstransformation. Eine MATLAB-Erweiterung, in der der Benutzer aufgefordert wird, auszuwählen, ob die Karte außerhalb oder innerhalb der Objektoberfläche berechnet werden soll, wird angezeigt. Wählen Sie ein Objekt mit der äußeren Oberfläche aus, um den Abstand zwischen den PLA-Flecken und der Oberfläche der Mitochondrien zu messen.
Sobald die Karte generiert wurde, wird sie als neuer Kanal im Anzeigeanpassungsfenster angezeigt. In diesem Kanal hat jedes Pixel einen Wert, der dem Abstand zu den nächstgelegenen Mitochondrien entspricht. Wählen Sie die zuvor generierten Punkte im Szenenbaum aus, um die Entfernung von jedem Punkt zum nächstgelegenen Mitochondrium zu messen und die nächstgelegenen Mitochondrien zu identifizieren und zu visualisieren.
Wählen Sie nun bestimmte Werte und die Zentrumsintensität des Kanals aus, die der Entfernungskarte in der Statistik und im detaillierten Protokoll entsprechen, um den Wert jedes Punktmittelpunkts zu messen, der seiner Entfernung zum Mitochondrium in der Entfernungskarte entspricht. Exportieren Sie die Daten als CSV-Datei, indem Sie auf das Diskettensymbol unten links im Fenster klicken. Um eine Subpopulation von Flecken basierend auf ihrer Entfernung zu den Mitochondrien zu extrahieren, wählen Sie die Flecken im Szenenbaum aus und klicken Sie auf die Registerkarte Filter.
Fügen Sie einen neuen Filter hinzu, der auf der Mittelintensität des Kanals basiert, der der Entfernungskarte in diesem Fenster entspricht, und extrahieren Sie die Flecken, die weniger als 380 Nanometer von den Mitochondrien entfernt sind, indem Sie den unteren Schwellenwert auf null Mikrometer und den oberen Schwellenwert auf 0,380 Mikrometer einstellen. Führen Sie einen Duplizierungsschritt durch, indem Sie auf die Schaltfläche Auswahl auf neue Spots duplizieren klicken, um sich auf die ausgewählten Spots zu konzentrieren. Konfokale Bilder von endogenem ORP5-ORP8 PLA zeigten Interaktionen in den HeLa-Zellen in den retikulären ER-, kortikalen ER- und ER-Subdomänen in engem Kontakt mit Mitochondrien, die allgemein als Mitochondrien-assoziierte ER-Membranen bezeichnet werden.
Die 3D-Bildgebungsanalyse zeigte, dass etwa 50 % der endogenen ORP5-ORP8-PLA-Interaktionen an Mitochondrien-assoziierten ER-Membranen nachgewiesen wurden. Der Prozentsatz der ORP5-ORP8-PLA-Interaktionen, die an Mitochondrien-assoziierten ER-Membranen in Zellen auftraten, die ORP5 und ORP8 gemeinsam überexprimierten, war ähnlich wie in Zellen, in denen diese Proteine auf endogenen Ebenen exprimiert wurden. Die Herunterregulierung von ORP5 und ORP8 induzierte eine massive Abnahme der Gesamtzahl der PLA-Signale, während ihre Co-Überexpression PLA erhöhte.
PLA-Signale wurden in ORP5-PTPIP51- und ORP8-PTPIP51-Paaren detektiert, und ihre durchschnittliche Anzahl war ähnlich wie beim ORP5-ORP8-PLA-Paar, was die Lokalisierung von ORP5 und ORP8 an ER-Mitochondrien-Membrankontaktstellen bestätigt. Darüber hinaus wird die Interaktion von ORP5-ORP8 PLA an ER-Plasmamembrankontakten in einer Drei-Wege-Kontaktstelle zwischen Mitochondrien, dem ER und Lipidtröpfchen unter Verwendung von HeLa-Zellen identifiziert, die mit PHPLCD-RFP oder mCherry-PLN1 transfiziert wurden. Wie bei jeder Bildanalysemethode ist die Bildqualität ein entscheidender Punkt, daher ist die Optimierung des Signals entscheidend für die automatische Erkennung der Objekte.
Diese Technik kann auch verwendet werden, um die Assoziationen zwischen zwei oder mehreren Zellorganellen zu untersuchen, wie wir es in unserer jüngsten Studie über die Funktion von ORP5 und ORP8 an den Drei-Parteien-ER-, Mitochondrien- und Lipidtröpfchen-Kontaktstellen getan haben. Diese Technik kann in anderen Studien auf dem Gebiet der intrazellulären Kommunikation hilfreich sein, um neue mehrteilige interorganelle Assoziationen zu identifizieren.
