Alle Autoren trugen in Richtung der Etablierung und Validierung des vorgestellten Assay und dem Entwurf des Manuskripts.

Alle Tierversuchsverfahren im Protokoll befolgen Sie die Tierpflege-Richtlinien der Technischen Universität München, Deutschland. 1. Medien / Auszug Vorbereitung <ol><li> Gewebehomogenisierung Die Qualität der Homogenisierung Gewebe ist für den nachfolgenden Nachweis von neuroplastischen Veränderungen in kultivierten Neuronen. Hier wird empfohlen, die ein Homogenisator Gewebedissoziation ermöglicht ohne große Erhöhung der Gewebetemperatur. <ol><li> Über 5 mm x 5 mm x 5 mm große Würfel von Pankreasgewebe direkt von -80 ° C bis flüssigem Stickstoff und in einer festen Phase im Gewebe homogenator. Die ideale homogenator würde das Gewebe schnell genug distanzieren, ohne dass es um aufzutauen. </li><li> Unmittelbar nach der Dissoziation, resuspendieren festen, pulverförmigen Homogenat in 300-500 ul 0,1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Hier verwenden Sie keine Lyse-Puffer (wie RIPA), da dies die Nervenzellen zu lysieren.</li><li> Zentrifugieren der Homogenate für mindestens 15 min bei maximaler Geschwindigkeit der Tischzentrifuge (z. B. 21.130 xg). Sammeln Sie die klare Überstand, der die Gewebeextrakt darstellt. </li></ol></li><li> Zelllinie Stände <ol><li> Lassen Sie die Zellen von Interesse zu erreichen mindestens zu 70 - 80% Konfluenz in normalem Wachstumsmedium. </li><li> Normalerweise werden diese Medien enthalten Serumkomponenten und können unkontrollierbare Auswirkungen auf die neuronale Wachstum ausüben. Deshalb wird nach Erreichen der gewünschten Zelldichte, waschen Sie Ihre Zellen mindestens 3x mit Zellkultur-Grade-PBS und legen Sie sie in Serum-freien Medium (SFM) für bis zu 48 Stunden. Hinweis: Hier berücksichtigen, dass bestimmte Zellen (wie Pankreassternzellen) Serum müssen in ihrem Wachstumsmedium, um ihre normalen Zustand und die Struktur aufrecht zu erhalten. In solchen Fällen führen serielle Verdünnungen Serum im Medium der Zelle von Interesse, um die bestmöglichen Serumgehalt für intakte Zelle notwendig funk findenn. </li><li> Messung der Proteinkonzentration der Gewebehomogenat oder Zellüberständen mittels Bradford-Proteintest. Obwohl diese Werte abhängig von der Gewebe-und Zelltyp variieren, Pankreasgewebeextrakte, würde man einen Konzentrationsbereich von 5-12 ug / ul zu erwarten, und für die Zelllinie Stände zwischen 3-8 ug / ul. </li></ol></li></ol> 2. Aliquot Extrakte und Zellüberständen Abhängig von der Konzentration in dem Assay verwendet werden, sollte die Endkonzentration des Extrakts oder der Überstand in der neuronalen Medium 100 ug / ml 5,8 sein. Anmerkung: Für einen Test mit Neuronen in 500 ul Medium wachsen in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen benötigt man 50 &amp;mgr; g Protein von jedem Extrakt oder Überstand pro Vertiefung. Bei einer typischen Extrakt-Konzentration von etwa 10 ug / ul, ein 5 ul Extrakt / Stand müssten für jeden gut. In jedem setting als dreifach durchgeführt, würde dies zu 15 ul Extrakt / Stand entsprechen. Für verschiedene Gewebe oder Zelltypen, führen serielle Verdünnungen der endgültigen Extrakt oder Überstand Konzentration und vergleichen Sie die beobachteten Effekte zwischen verschiedenen neurotrophen Extrakt / Stand Konzentrationen. 3. Isolierung von Neuronen Wenn der Extrakt / Stand Sammlung abgeschlossen ist, weiter mit Isolierung von Nervenzellen. <ol><li> Für DRG-Neuronen, sammeln die Hals zu neugeborener Ratten zwischen postnatalen Tag (P) 12.2 nach Enthauptung und stereomikroskopische Präparation der DRG (Abbildung 1A) lumbalen DRG. Um eine ausreichende DRG-Neuronen für eine 24-Well-Platte haben, sammeln sie alle Gebärmutterhalskrebs zu einer neugeborenen Ratte (entspricht 52 DRG) pro Platte lumbalen DRG. <ol><li> Schneiden Sie den peripheren (neuronalen) und Zentralprojektionen (Wurzeln) der DRG mittels Mikroschere. Lässt man die Projektionen in Verreiben Ort behindert und erhöht ter Kontaminationsrisiko der Kultur von Fibroblasten. </li></ol></li><li> Für MP Neuronen, schneiden Sie das Gekröse aus dem Dünndarm und von Hand vorsichtig abstreifen seromuskuläre Schicht des Dünndarms (für eine detaillierte Protokoll über MP Isolation, siehe Schäfer et al. 9, Abbildung 1B). Für MP, sammeln die Plexus aus zwei Ratten pro 24-Well-Platte. Hinweis: Versuchen Sie, so sanft wie möglich zu sein, um Risse in der seromuskuläre Schicht zu vermeiden, da sie die erfolgreiche Trennung von der Dünndarm behindern. </li><li> Sammeln Sie die DRG und seromuskuläre Schicht in eiskaltem Minimalmedium (MEM) mit Gentamicin (20 mg in 500 ml Medium) und Metronidazol (2,5 mg in 500 ml Medium) geliefert. </li><li> Nach Sammlung von DRG, inkubieren in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit Collagenase Typ II für 20-30 min zugeführt. Für MP Isolation, Inkubation in Collagenase Typ zwischen 1-3 Stunden, je nach Alterdes Tieres (Abbildung 1C). </li><li> Für MP, sammeln die netzartige MP Stücke unter Stereomikroskop und Transfer zum eiskalten MEM. </li><li> Dann verreiben Sie die DRG und MP durch Spritzen mit abnehmendem Durchmesser. Hinweis: Überhöhte Verreiben können die Neuronen weniger die Gliazellen zu zerstören, aber. </li><li> Sobald das Medium, das die DRG oder MP hat sich bewölkt, Zentrifuge die Suspension bei 93,9 g für 5 min, entsorgen Sie die mittel-und resuspendieren in Neurobasal Medium (mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 0,5 mM L-Glutamin und 2% B-27). </li><li> Zählen der Gesamtzahl der Zellen (dh Neuronen und Gliazellen) mittels einem Hämozytometer. Anmerkung: Die Anzahl der benötigten Zellen ist abhängig von der Messgröße. Für die Quantifizierung von Neuriten Dichte, dichter Kulturen und somit eine größere Anzahl von Zellen als für die Messung von Neuritenwachstum, perikaryonal Größe benötigt manund Verzweigungsmuster einzelner Neuronen. Für Neuriten Dichtemessungen, verwenden Sie zB 10.000 Zellen (Neuron + Glia) / gut oder 1500 Neuronen / gut. Für Morphometrie von einzelnen Neuronen, kurz (1 Minute lang) Trypsinierung der Zellen und der Aussaat von 2500 Zellen / Well oder 400 Neuronen / Vertiefung wird empfohlen. Die typische Ausbeute an Zellen aus einer Ratte erhalten etwa 300.000-500.000 Zellen. </li><li> Samen der Zellen auf 13 mm Deckgläschen, die wurden in der Nacht überzogen haben, bevor die Brunnen und oben mit Neurobasal Medium (mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 0,5 mM L-Glutamin und 2% B-27) (Abbildung 1D). Hinweis: Verwenden Poly-D-Lysin (40 mg / m 2) oder Ornithin-und Laminin-beschichtete (1 mg / ml) beschichteten Deckgläschen. Zellen zu befestigen, um Poly-D-Lysin extrem schnell, so dass es für Experimente, in denen viele Zellen benötigt werden (dh Neuriten Dichtemessungen) geeignet. Anbau an Laminin ist in der Regel einigewas schwächer, aber Laminin ist ein starker Förderer der Neuritenwachstum. Daher ist für Messungen an Nervenverzweigungen und Neuritenlänge bevorzugen Ornithin / Laminin-Beschichtung. </li><li> Damit die Zellen heften sich an die Brunnen über Nacht. Am nächsten Tag, bereiten die Extrakt-ergänzten Medium (zu einer endgültigen Extrakt / Überstand Konzentration von 100 ug / ml). </li><li> Saugen Sie den Aussaatmedium und führen Sie eine optionale, sehr sanft mit PBS gewaschen, und dann langsam pipettieren den Extrakt / Stand-Medien ergänzt (1E). </li><li> Lassen Sie die Zellen wachsen für 48 Stunden. Saugen Sie die Medien und fix in 4% Paraformaldehyd für Immunfärbung (1F). </li><li> Führen Doppelimmunfluoreszenzfärbung mit Neuronen-spezifischen (z. B. beta-Tubulin-III) und Glia-spezifisch (zB Gliazellen fibriallary sauren Protein / GFAP) Marker (1G). </li><li> Für Morphometrie, verwenden Sie einen invertierten Lichtmikroskop mit einer CCD-Kamera in Kombination wi ausgestattetth automatisierte Software, die die Messung von Neuriten Dichte ermöglicht (siehe Tabelle). </li><li> Die Neuriten Dichte von neuronalen Kulturen auf 4-5 Vertreter mikroskopische Aufnahmen bei 200-facher Vergrößerung aus 4 verschiedenen Regionen der dichtesten Wachstum auf jedem Deckglas durch Überlagerung ein 50 um x 50 um Netz und Zählen der Faserdichte pro Quadratmeter in den Schnittfasern gemessen. Neuritenwachstum, mittlere Anzahl der Filialen pro Neuron kann die mittlere Zweig Länge und perikaryonal der Größe von 30 zufällig ausgewählten Einzelneuronen von jedem Deckglas durch Markieren der Neuriten und Perikarya (1H) gemessen werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract:+chronic+inflammation,+neurotrophic+signals,+and+hypersensitivity.">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li><li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation.">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li><li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation.">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity.">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li><li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally.">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li><li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system.">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li><li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer.">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li><li>Sch&#228;fer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract.">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma.">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin/GFRalpha2+axis.">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li><li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen und keine finanziellen Angaben.

Das vorliegende Protokoll soll die Methodik hinter der in-vitro-Assay Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität, die kürzlich von unserer Arbeitsgruppe entwickelt wurde, um die Mechanismen der Neuroplastizität bei PCa und CP 5 studieren zu veranschaulichen. Das Protokoll beinhaltet einen dreitägigen Prozedur, die leicht angewendet werden können, sobald die Darsteller hat ausreichende Erfahrung bei der Isolierung und Kultur von DRG-und MP-Neuronen gewonnen werden. Darüber hinaus stellt es ein wertvol...

Veränderungen im Magen-Darm-(GI) Nerven Morphologie und Dichte haben die Aufmerksamkeit der Gastroenterologen und Pathologen für eine lange Zeit gefangen, aber ihre Bedeutung für die Pathophysiologie der GI-Erkrankungen ist unbekannt 03.01. Tatsächlich sind mehrere hoch gemeinsamen GI-Erkrankungen wie Gastritis, Reflux-Ösophagitis, Kolitis, Divertikulitis, Appendizitis und mit erhöhter Innervationsdichte in entzündeten Gewebebereiche 1 zugeordnet. Es wurde jedoch keine echte Aufmerksamkeit bisher auf die Mechanismen und Bedeutung der Neuroplastizität im GI-Trakt bezahlt. Sie morphologisch veränderten GI Nerven unterscheiden sich von normalen GI Nerven, also der Normalzustand des enterischen Nervensystems, in ihrer Funktion? Was sind die Auswirkungen von veränderten Neuropeptid / Neurotransmitter Gehalt in magensaftresistenten Kunststoff Nerven? Hat peripheren Neuroplastizität immer bringen veränderte Signalisierung an das zentrale Nervensystem? Und wo sind die zentralen Projektionen der Kunststoff ExtriNSIC GI Nervenbahnen? Eine lange Reihe von Schlüsselfragen wie leicht, wenn man den Mangel an unserer Kenntnisse über die funktionalen Aspekte der Neuroplastizität GI erzeugt werden. Die Studie von GI Neuroplastizität bei Funktionsebene erfordert gültige, reproduzierbare und noch leicht anwendbar experimentellen Modellen. In einer Zeit zunehmender Beliebtheit und Akzeptanz von gentechnisch bedingte Mausmodellen (GECoMM), wie in vivo-Einstellungen tragen das Potenzial, bisher unbekannte Facetten der GI Neuroplastizität in einer realistischen Art und Weise ein aufzuklären. Jedoch bleibt die Konstruktion und Produktion von GECoMM teuer, arbeitsintensiv und vor allem zeitaufwendig ist. Darüber hinaus erfordern sie die a-priori-Auswahl des Ziel bedingt in der genetisch veränderten Maus (z. B. transgene Überexpression von Nervenwachstumsfaktor / NGF in enterischen Epithelzellen) moduliert werden. Daher ist für die DESign einer erfolgreichen GECoMM, brauchen die Forscher einige Indikatoren (z. B. früheren experimentellen Daten) einer lohnendes Ziel, das heißt, dass das Molekül von Interesse (hier NGF) zumindest erwartet, dass einige biologisch relevante Auswirkungen auf die GI Nerven auszuüben. Solche Indikatoren können leicht von in-vitro-Modellen, in denen ausreichende isolierten Zelltypen aus der komplexen Mikroumgebung eines In-vivo-System kann wahlweise in einem hetero Weise 4-7 kokultiviert werden, abgeleitet werden. Die Modulation des molekularen Targets in einer solchen heteroKulturEinstellung beträgt durchschnittlich technisch weniger aufwändig, schneller, und kann daher in der Vorfilterung lohnenswertes Ziel unterstützen zur Überprüfung in in vivo-Studien. Kürzlich haben wir eine in-vitro-Assay Neuroplastizität, die entworfen wurde, um die erhöhte neuronale Dichte und Hypertrophie der intrapankreatischen ne simulierenRVE im menschlichen Pankreas-Krebs (PCa) und chronischer Pankreatitis (CP) Gewebe. Hier wurden Neuronen aus neugeborenen Ratten dorsalen Wurzelganglien (DRG) und Plexus myentericus (MP) abgeleitet wird, um Gewebeextrakten von chirurgisch entfernten PCa oder CP Geweben Proben belichtet und im Vergleich zu denen in normalen menschlichen Bauchspeicheldrüse (NP) Gewebeextrakte 5 kultiviert. Anstelle von Gewebeextrakten, kann man auch Zelllinie Stände, die Auswirkungen der ausgewählten Zelltypen auf Neuroplastizität zu studieren. Wenn eine standardisierte morphometrische Messungen kombiniert werden, kann der Test gültig präsentiert Neuroplastizität und reproduzierbaren Beurteilung von neuronaler Plastizität in Reaktion auf verschiedene pankreatischen Mikroumgebungen. Insbesondere ermöglicht es die Simulation 1) morphologische Neuroplastizität, dh die Änderungen in der Neuritenwachstum, Verzweigungsmuster und neuronalen Größe und 2) funktionelle Neuroplastizität, dh Veränderungen in der Erregbarkeit von peripheren Neuronen. Darüber hinaus sind nicht nur Peripheriegerät ( </em&gt; Ente), aber auch zentral (zB DRG oder zweiter Ordnung Rücken) Neuronen können in der vorliegenden Assay auf ihre morphologischen und funktionellen Reaktion auf verschiedene Gewebe GI Inhalt bewerten einbezogen werden. In dem vorliegenden Video-Tutorial zeigen wir, das technische Protokoll für die Durchführung dieses Tests und diskutieren seine Vorteile und Schwächen. Darüber hinaus weisen wir auf die Anwendbarkeit der Grundgedanke dieses Assays zum Studium der Neuroplastizität in jedem GI Orgel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P1149</td>
			<td style="width:328px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ornithine/laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2533/L4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13mm coverslips</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>For use in 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dismembranator S</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Beta-III-tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1637</td>
			<td>1:200 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFAP-antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0761</td>
			<td>1:400 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RIPA buffer + protease inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Quality of B-27 is known to depend on the lot number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin/Metronidazol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimal essential medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>31095-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>24020133</td>
			<td>Improves collagenase activity when containing Ca/Mg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>Obtain lots with at least 200U/mg activity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA 0,25%</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">analySIS docu software</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay

Neuroplastizität ist ein inhärentes Merkmal des enterischen Nervensystem und Magen-Darm-(GI) Innervation unter pathologischen Bedingungen. Allerdings bleibt die pathophysiologische Rolle der Neuroplastizität in GI-Erkrankungen bekannt. Neuartige experimentelle Modelle, die Simulation und Modulation der Neuroplastizität GI erlauben kann verbesserte Wertschätzung des Beitrags der Neuroplastizität insbesondere GI Krankheiten wie Bauchspeicheldrüsenkrebs (PCA) und chronischer Pankreatitis (CP) zu ermöglichen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Simulation von Bauchspeicheldrüsen neuroplasticity unter in vitro Bedingungen mit neugeborenen Rattenhinterwurzelganglien (DRG) und Plexus myentericus (MP) Neuronen. Diese Dual-Neuron-Ansatz ermöglicht nicht nur die Überwachung der beiden Orgel intrinsische und extrinsische-Neuroplastizität, sondern auch ein wertvolles Werkzeug, um neuronale und gliale Morphologie und Elektrophysiologie zu beurteilen. Darüber hinaus ermöglicht es funktions Modulation der mitgelieferten Mikroumgebungs Inhalte für das Studium ihrer impact auf Neuroplastizität. Einmal eingerichtet, ist die vorliegende Neuroplastizität Assay trägt das Potenzial, für das Studium der Neuroplastizität in jedem GI Orgel.

Morphologische Neuroplastizität In der angegebenen Altersbereich von neugeborenen Ratten (P2-12) und den Einsaatdichten, MP und DRG-Neuronen bereits dichte neuronale Netze bauen nach 48 h (Abbildung 2A). Vergleich von Neuriten Dichte zwischen Neuronen in PCa, CP kultiviert und NP Extrakte zeigt größere Dichte von Neuriten-DRG-Neuronen in PCa-oder CP-Extrakte als NP-Extrakte (2A) 5. Wir bevorzugen insbesondere MP Neuronen für Messungen...

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Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronale Plastizität ist eine zunehmend erkannt, aber unzureichend verstanden Funktion des Magen-Darm (GI-Trakt). Hier im Beispiel der menschlichen Bauchspeicheldrüse, stellen wir einen in vitro-Assay Neuroplastizität für die Untersuchung der neuronalen Plastizität im GI-Trakt sowohl morphologischen und funktionellen Niveau.

Simulation von Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität:<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zwei-Neuron-Plastizität Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

simulating-pancreatic-neuroplasticity-vitro-dual-neuron-plasticity

Research

JoVE Journal

Medicine

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

9.7K Aufrufe.  Technische Universität München.  Neuronale Plastizität ist eine zunehmend erkannt, aber unzureichend verstanden Funktion des Magen-Darm (GI-Trakt). Hier im Beispiel der menschlichen Bauchspeicheldrüse, stellen wir einen in vitro-Assay Neuroplastizität für die Untersuchung der neuronalen Plastizität im GI-Trakt sowohl morphologischen und funktionellen Niveau. 

Serie: Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Forschung

Medizin

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio based cues and set within the context of a video game metaphor, users gather relevant spatial information regarding a building's layout. This allows the user to develop an accurate spatial cognitive map of a large-scale three-dimensional space that can be manipulated for the purposes of a real indoor navigation task. After game play, participants are then assessed on their ability to navigate within the target physical building represented in the game. Preliminary results suggest that early blind users were able to acquire relevant information regarding the spatial layout of a previously unfamiliar building as indexed by their performance on a series of navigation tasks. These tasks included path finding through the virtual and physical building, as well as a series of drop off tasks. We find that the immersive and highly interactive nature of the AbES software appears to greatly engage the blind user to actively explore the virtual environment. Applications of this approach may extend to larger populations of visually impaired individuals.

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind.

Entwicklung eines Audio-based Virtual Gaming Umwelt mit Navigation Skills in the Blind Assist

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

Einem Mausmodell der zervikalen Rückenmarksverletzung zu Post-läsionaler Atemneuroplastizität Studieren

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-Elektroden-Array Recordings of Human Epileptische Postoperative Rindengewebe

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Die Beurteilung Transmissible Spongiforme Enzephalopathie Artgrenzen mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Prion Protein-Umwandlungsassay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &amp;#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of pancreatic body. With technological development, the robotic surgical system has shown its advantage in minimally invasive surgery and been increasingly applied in central pancreatectomy. However, reconstruction of the continuity of pancreas with end-to-end anastomosis after robotic central pancreatectomy has not been applied. In this study, we report surgical techniques for robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis. The pancreas is reconstructed by duct-to-duct anastomosis of the pancreatic duct with a pancreatic stent inserted in the two stumps of pancreatic duct, and by end-to-end anastomosis of the pancreatic parenchyma. Compared with traditional central pancreatectomy with pancreaticoenteric anastomosis, this approach decreases the operative injury to the patient, and also conserves the integrity and continuity of the digestive duct and pancreatic duct. The robotic surgical system integrated with multiple instruments with flexible and precise movement is particularly suitable for the dissection and reconstruction of the pancreatic duct. We found that robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is safe and feasible, and we need more experience to evaluate its best indications and long-term outcomes.

The robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is feasible and safe for tumor in the pancreatic neck and proximal portion of pancreatic body. The operative techniques of this operation are presented.

Anwendung von End-to-End-Anastomose in Roboter-zentrale Pankreatektomie

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraportal Transplantation der Bauchspeicheldrüse Inselchen im Mausmodell

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...