Name: a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies
Uploaded: 2014-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies at JoVE.com

Die Autoren danken den technischen Mitarbeitern des Translational Research Unit; Mary Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni und die Informatik-Team am Institut für Pathologie der Universität Bern.

HINWEIS: Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Inselspital, Bern, Schweiz (07-10-13) genehmigt worden. Gewebe wurden von der Tumorbank Bern, Institut für Pathologie der Universität Bern erhalten. 1. Planung und Design (Consulting) <ol><li> Denken Sie über die Forschungsfrage beantwortet werden. Entscheiden Sie sich für den Gewebetypen, die in das Projekt einbezogen werden. Bestimmen Sie, was histologische Strukturen sind wichtig, um die Frage zu beantworten. </li><li> Festzustellen, die die nützlichsten Kerndurchmesser und die Anzahl der Kerne pro Patient für das Projekt. Entscheidet über die Anzahl der Kopien der nächsten Generation Tissue Micro Array (ngTMA) bezogen auf die Menge der Biomarker zu untersuchen. </li><li> Betrachten statistische Aspekte wie Stichprobengröße und-Analyse nach der Tissue Microarray (TMA) aufgebaut ist. Bestimmen Sie die Anzahl der Patienten, für die Aufnahme in die Studie und zu etablieren Kontrollgeweben für das Array. </li><li> Rufen Sie die histologische (oderDiagnose) Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Dias von jedem Patienten. Kurz die Dias und bestimmen Sie diejenigen, die relevante Informationen und Histologie für das Projekt. HINWEIS: Stellen Sie neue Abschnitte der Paraffinblöcke, wenn besondere Flecken oder Immunhistochemie Schlitten für Dias Scannen und Annotation gewünscht, anstelle von H &amp; E Dias </li></ol> 2. Schieben Scanning <ol><li> Schalten Sie PC und Dia-Scanner und Scan-Software geöffnet. Wählen Sie &quot;Automatik-Modus&quot; für Hellfeld Scannen von der Vorschau-Bildschirm. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Scan-Optionen&quot;, um die Diashow Qualitätsparameter einzustellen. Zu diesem Zeitpunkt wählen, ob Träger werden direkt auf die digitale Plattform von Internet oder auf einem lokalen Laufwerk (oder externes Laufwerk) zugänglich gescannt werden und stellen die Arten des Scannens und der Anzahl der Schwerpunkte. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Server-Parameter&quot;, um zum &quot;Case-Center&quot; zu scannen. In diesem Schritt fügen Sie mehr Zeitschriften, beschriften alle Folien und setzender Ordner in der Rechtssache Center, wo die Folien gespeichert werden sollen. Jedes Magazin kann bis zu 25 Dias. </li><li> Überprüfen Sie die Qualität / Sauberkeit tatsächlichen histologischen Präparaten für das Scannen. Falls notwendig, reinigen Folien mit 70% Ethanol. </li><li> Legen Sie bis zu 25 Objektträger pro Magazin mit dem nach innen weisenden Etiketten (3A) </li><li> Legen Sie das Magazin in den Scanner. Für mehr als ein Magazin, legen Sie sie auf der jeweils anderen. </li><li> Dia scannen, indem Sie auf den grünen Pfeil (3B). Wenn alle Objektträger gescannt werden, entladen die Zeitschriften und schloss das Programm ab, PC und Dia-Scanner. </li></ol> 3. Digital Slide Annotation <ol><li> Geben Sie die Browser-Adress für digitale Dia-Management-Center und laden Sie die kostenlose digitale Dia-Viewer-Software. </li><li> Öffnen Sie die digitale Dia-Viewer-Software und wählen Sie den Ordner mit den digitalen Objektträger (4A). </li><li> Notizen hinzufügen, neu anordnen und verwalten die digital Dia-Ordner oder Benutzerrechte vergeben, um Kollegen oder Anlagen hinzufügen zu dem Ordner. </li><li> Klicken Sie auf die gewünschte digitale Dia in der digitalen Dia-Betrachter angezeigt. </li><li> Mit Hilfe der Vergrößerungswerkzeug, bewerten Sie die Folie und finden Sie die Gegenden für die Integration in die ngTMA. </li><li> Mit dem &#39;TMA Anmerkungswerkzeug &quot;, wählen Sie die Größe des gewünschten Kern und die Farbe der Annotation. Legen Sie die Anmerkung auf der digitalen Dia indem Sie darauf klicken (Abbildung 4B). </li><li> Bewegen Sie die Annotation zu den gewünschten histologischen Strukturen zur Einführung in das ngTMA (4C). </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang der Annotation wieder mit Hilfe der Anmerkungswerkzeug, die Auswahl einer Kerngröße und einer gewünschten Annotation Farbe. Wiederholen Sie den Schiebe Betrachtung und Kommentierung auf allen Folien im Ordner. </li><li> Alternativ legen Gewebe Kerne für die PCR in 0,2-ml-Röhrchen statt Integration in die TMA. Anmerkungen versehen Folien mit einer anderen Farbe zu identifizierenDiese Spots für weitere molekulare Analyse. </li><li> Erstellen Sie eine Liste aller Fälle mit den entsprechenden Anmerkungen und Farben. </li></ol> 4. Tissue Microarray Bau <ol><li> Rufen Sie die entsprechenden Paraffingewebeblöcke für alle digitalen kommentierte Dias, sortieren Blöcke in der gewünschten Reihenfolge für die Gewebemikroarray. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Gewebeblöcke haben ein Minimum von 4 mm Dicke. Wenn nicht, ist Rückbettung von Gewebe notwendig. </li><li> Schalten Sie den PC &quot;ON&quot; und automatisierte Gewebemicroarray-Instrument. Öffnen Sie das Gewebe Microarray-Software und geben Sie einen Namen für das Projekt </li><li> Führen Sie einen &quot;Werkzeugwechsel&quot;, und wählen Sie die gewünschte Werkzeugdurchmesser für das Projekt (dh 0,6, 1,0, 1,5 oder 2,0 mm). </li><li> Legen Sie bis zu 12 &quot;Empfänger&quot; TMA-Blöcke in die Maschine. Geben eine ID zu jedem der 12 Blöcke </li><li> Erstellen Sie eine TMA-Layout für jede Empfängerblock. Beobachten Sie eine TMA-Design mit der Anzahl der Zeilen, Spalten und zuvorkommeny-Linien sowie Abstand zwischen den Kernen. Ein neues Layout für die einzelnen Empfängerblock oder verwenden Sie das gleiche Layout wiederholt. </li><li> Platzieren Sie den Cursor auf dem Empfängerblock-Layout, um die ersten Kern nehmen. </li><li> Als nächstes laden bis zu 60 Spenderblöcke in das Gewebe Microarray (5A). Zeigen zehn Blöcke in jeder Zeile von A bis F. Geben Sie jedem Block ein Spender ID. Bilder von jeder Spenderblock beobachten auf dem Computerbildschirm automatisch vom Gewebe Microarray erworben. </li><li> Beginnend mit dem ersten Block, klicken Sie auf &quot;Verschieben&quot;. Beachten Sie die annotierte digitale Dia in der digitalen Dia-Management-Center (oder auf dem externen Laufwerk) gespeichert unter Verwendung der digitalen Dia-Betrachter. Anzeigen des Bildes und des Spenderblocks und die digitale Dia Seite-an-Seite. </li><li> Auswahlreferenzpunkten auf dem Block Bild zu dem Spenderblock Bild mit dem digitalen Objektlagern </li><li> Nach dem Klick auf &quot;Weiter&quot;, beobachten die Anmerkungen auf ein größeres Bild des Blocks. (5B &lt;/ Strong&gt;). Klicken Sie oben auf die Anmerkungen zu bestätigen, und klicken Sie auf &quot;Start&quot;. HINWEIS: Dies fordert das Gewebe Microarray starten ein Loch von 0,6 mm Durchmesser in der Empfängerblock bei der gewählten Ausgangspunkt. Dann in einem zweiten Schritt unter Verwendung des Stanzwerkzeugs, stanzt das Instrument Loch im Gewebe der ausgewählten Spenderblock in der genauen kommentiert und bestätigt Region. Kerne werden dann aus dem Spender auf den Empfänger übertragen Block. </li><li> Nach etwa 500 Kerne, reinigen Sie den Bohrer und Stanzwerkzeug mit einem Putzlappen Xylol. </li><li> Wenn Gewebe Kerne sind erwünscht (eher als Schläge in ein ngTMA), klicken Sie auf den &quot;PCR&quot;-Tool für den Block, bestätigen bis zu 4 Anmerkungen und klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Dies wird Punsch und übertragen Sie die Kerne in einer 0,2-ml-Tube. </li><li> Wiederholen Sie Punkt 4,9-4,11 mit der zweiten Spenderblock, und so weiter. </li><li> Nach der Verwendung alle Spenderblöcke, geben Sie eine zweite Runde der Spenderblöcke (61-120) in das Gewebe-MikroarrayER und weiterhin Schritte 4,8-4,11. </li><li> Aktualisieren Spender und Empfänger Blockbilder während der Projektfortschritt beim Bohren und Stanzen auftritt (Abbildung 5C). </li><li> Führen Sie eine &quot;Export&quot;, nachdem das Projekt abgeschlossen ist. Suchen Sie die Datei mit den .xslx Spender und Empfänger-Block-IDs, die Lokalisierung aller Schläge innerhalb der TMA sowie der TMA-Layout / Design, in der exportierten Ordner. Speichern Sie alle Bilder Spenderblock mit allen überlagert Annotation als jpg-Bilder in der exportierten Ordner (5D). Der letzte Block TMA ist dann bereit. </li></ol>

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The authors have no disclosures

In diesem Beitrag wird ein Protokoll für ngTMA beschrieben. ngTMA ist ein neu etabliertes Konzept zur Gewebemikroarray mit Planung und Design, digitale Pathologie und Dia-Annotation sowie automatisierte Gewebemikroarray-12. Im Vergleich zu herkömmlichen Gewebemikroarray bietet ngTMA viele Vorteile. In einem ersten Schritt wird die Projektierungsphase kritisch. Der Schwerpunkt liegt auf der Beantwortung einer gezielten Fragestellung. Dies sollte berücksichtigt werden die histologischen Fragen (zB, welche Regionen und wie viele Flecken will ich gehören?), Die statistische Planung (zB Stichprobengröße? Wie kann ich meine Proben später zu analysieren?) Und logistische Überlegungen (zB wie viele Biomarker und daher, wie viele Kopien ngTMA?). Eine spezifische ngTMA wird für die spezifischen Bedürfnisse gemacht, ob es für Biomarker-Screening und High-Throughput-oder, um spezifische histologische Aspekte nur auf ein paar gut ausgewählte cas studierenES. Eine, wenn nicht die, am wichtigsten Nachteil herkömmlicher Gewebemikroarray die geringe Genauigkeit, mit der Markierungen auf den histologischen Objektträgern hergestellt werden. Die histologische Untersuchung spezifischer Strukturen, Zellen oder Bereiche nahezu unmöglich gemacht. ngTMA ermöglicht hohe Genauigkeit, da Anmerkungen direkt auf den digitalen Objektträger platziert. Dies ermöglicht dem Forscher, genau Wählen Sie die Regionen gestanzt werden, einschließlich spezifischer Zellen. In diesem Beispiel sind die verschiedenen Bereiche innerhalb des gleichen Gewebeblock aus zum Ordnen tanzt, wie die Tumorzentrum der Invasionsfront und Bereiche der Tumor / Stroma-Wechselwirkung durch das Vorhandensein von kleinen Tumorzellhaufen oder sogar einzelne Zellen markiert. Diese Genauigkeit kann nur mit ngTMA erreicht werden. Drittens, weil Objektträger werden auf einem Web-basierten digitalen Plattform abgetastet gleiten Ansicht und Kommentierung durch den Computer nicht mit dem Mikroskop durchgeführt werden. Das Gewebe Anordnungs Software bietet eine benutzerfreundlicheSchnittstelle mit einem hohen Grad an Flexibilität und damit verschiedene Layouts und ngTMA Design erreicht werden kann. Da TMA Aufbau wird automatisch durch Bohren durchgeführt wird, gibt es wenig Notwendigkeit für praktische Manövrieren und die Zeit für die Konstruktion erheblich reduziert. Die Zeit für die TMA Bau in diesem Beispiel ist hier zwischen 24 Stunden. Bei Verwendung eines herkömmlichen TMA Ansatz und Schätzen 15 Schläge pro Stunde, wäre dieses Projekt etwa 304 Stunden zu nehmen. ngTMA kann angewendet werden, um Protein-Expression, mRNA oder DNA sowie Kombinationen davon zu untersuchen. 9 veranschaulicht einige dieser Anwendungen potentielle Biomarker. Standard Immunhistochemie angewendet werden, um die Verbreitung von Krebserkrankungen unter Verwendung von Index Ki-67 zu bestimmen. Ein kombinierter Ansatz zur Proteinexpression und DNA-Amplifikation für Gene wie HER2 Untersuchung verwendet werden. Gewebe können auf einem einzigen ngTMA versammelt, um Kosten, Auslastung und anderen Gewebe Ressource zu verringerns. Zusätzlich können chromogene mRNA in situ Hybridisierung für HER2 und andere Gene durchgeführt werden, um einzelne mRNA-Transkripte in einer Vielzahl von Fällen unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Gewebeschnitten zu identifizieren. Immunhistochemie von Immunmarker, wie CD8 können im Rahmen der Tumormikroumgebung dargestellt werden. Doppel Immunhistochemie kann auch verwendet werden, wie Interaktionen zwischen Immunzellen (rot markiert) und Tumorzellen (in braun markiert) an der Invasionsfront von Krebs auf bestimmte Bereiche von Interesse zu markieren. Solch ein Bereich von Interesse nicht unter Verwendung herkömmlicher Gewebemikroarray erfasst haben. Dennoch enthält diese Protokoll einige Einschränkungen. Die wichtigste Herausforderung ist die Überlappung zwischen Donor-Block und digitale Dia. Mehrere Faktoren können diesen Schritt zu beeinflussen. Erstens sollte der letzte Abschnitt des Blocks für Dia Scannen verwendet werden. In vielen Fällen ist das H &amp; E ist nicht der letzte Abschnitt des Spenderblocks, Käther ist es ein immunhistochemischen oder anderen Fleck. In diesem Fall wird auch ein gefärbtes Schieber verwendet werden, solange der letzte Fleck abgetastet und annotiert oder einer neuen H &amp; E vorgenommen werden sollen. Vorsicht ist auch bei der Gewebeschnitte werden gemacht, wie Gewebe können im Wasserbad, die anspruchsvolle Anpassung der Rutsche und Block führt zu erweitern. Zweitens, im Moment Projekte bis 12 Empfänger TMA Blöcke auf einmal verarbeitet beschränkt. Größere Projekte von mehr als 12 TMAs muss zu einer zweiten Projektnamen zugeordnet werden. Drittens müssen die Spenderblöcke mit Standard-Formen und-Kassetten als das Instrument kann sich nicht auf verschiedene Größen einstellen werden. Schließlich müssen die Spenderblöcke minimale Höhe (4 mm), um eine optimale Bohrung erzielen überschreiten. In einigen Fällen erfordert dies Rückbettung von Geweben. Hunderte von Publikationen in den letzten Jahren unterstreichen die TMA als ein unschätzbares Werkzeug für Biomarker-Forschung. TMAs wurden verwendet, um Lungen 13, kolorektalen 7, bre studierenAST 14, 15 Prostata, Pankreas 16, der Blase 17 und Magenkrebs 18, um nur einige zu nennen. Eine zunehmende Anzahl von Autoren haben die Verwendung von TMA mit Bildanalyse und bedeutende Schritte werden in dieser Richtung gemacht 19-21 zusammengefasst. Doch neben einer Handvoll von Forschungsgruppen, die innovative Ideen TMA 22-24 veröffentlicht haben, wenig Aufmerksamkeit gegeben worden, um die TMA-Technik selbst zu optimieren. Automatisierte Gewebe Microarrayer, wie der ATA-27 um Estigen / Beecher tun geben Layout-Design und zweckmäßige und automatisierte Gewebe Stanzen. Dies stellt jedoch nur ein Aspekt der ngTMA Konzept. ngTMA ist eine wesentliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Gewebemikroarray-Techniken. Es enthält Fachwissen in der Histologie und TMA-Design mit der Flexibilität der digitalen Pathologie und der Genauigkeit der digitalen Anmerkungen mit der Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit des automatischen TMA Konstruktion. Die Kombination NGTMA und Bildanalyse zur Auswertung von Protein und molekulare Biomarker wird ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Qualität der klinischen und translationalen Forschung in der Zukunft weiter zu verbessern.

In den letzten zwei Jahrzehnten haben Tissue Microarrays (TMA) einen bemerkenswerten Einfluss auf die Biomarker-Untersuchung Studien hatten. TMAs sind im wesentlichen Gewebe &quot;Archive&quot; durch die wiederholte Übertragung von kleinen Gewebekerne, in der Regel in einer Größe von 0,6 bis 2,0 mm Durchmesser hergestellt, aus Paraffin eingebettet &quot;Spender&quot;-Blöcke in einem einzigen TMA &quot;Empfänger&quot;-Block (Abbildung 1) 1. Mit einem kleinen Kerngröße, können etwa 500 verschiedene Gewebeflecken aus wenige oder viele verschiedene Patienten in einen TMA 2 angeordnet werden. Die Verwendung von TMA für prognostische oder prädiktive Biomarkerstudien hat viele Vorteile. Man betrachte das Beispiel, wo die Expression eines Proteins Biomarker durch Immunhistochemie ist an 450 Patienten ausgewertet. Anstatt der Durchführung 450 immunhistochemische Färbungen auf 450 Patienten Folien aus der gleichen Anzahl von Blöcken unterteilt, können kleine Kerne von jeder Probe auf einem einzigen T angeordnet werden,MA-Block. Auch wenn mehrere Kerne werden von jedem einzelnen Patienten entnommen werden eine minimale Anzahl von Blöcken erzeugt. Das hat den erheblichen Einfluss von Kosten und anderen Ressourcen drastisch abnehm sowie die Verringerung Gewebe Verschwendung. Zusätzlich ermöglicht dies angemessen versorgt Studien unter Verwendung einer großen Anzahl von Geweben unter den gleichen experimentellen Bedingungen ausgewertet werden. TMAs haben viele verschiedene Anwendungen. Zum Beispiel können sie verwendet werden, um die Morphologie, Proteinexpression, RNA-Expression und DNA-Aberrationen folgenden Färbung mit verschiedenen Farbstoffen zu untersuchen, oder nach Immunhistochemie oder chromogene und selbst Fluoreszenz in situ Hybridisierung 3-7. Jüngste Studien haben auch den inner TMAs und Ring Variation in Färbeprotokollen testen, stellen Spezifität oder Sensitivität von Antikörpern für bestimmte Gen-Mutationen und die Interobserver Reproduzierbarkeit der Proteinexpression in internationalen Kooperationen bestimmen <sup&gt; 8-11. Der Bau der traditionellen TMAs mit Patienten stammenden Gewebe ist eine lange Mehrschritt-Verfahren (Abbildung 2). Es beginnt mit der Suche nach möglichen geeigneten Fällen und Auswahl von Diagnose Dias aus dem Archiv in einem Institut für Pathologie, oder andere Institut, von wo sie abgerufen werden. Der Pathologe beurteilt die Folie pro Fall und wählt die Vertreter Rutsche für die Zwecke der Studie. Als nächstes wird der interessierende Bereich mit einem Stift unter dem Mikroskop direkt markiert. Dies ist oft schwierig und ungenau und führt nur zu einer &quot;Schätzung&quot;, wo Gewebe Schläge vorgenommen werden soll. Danach werden die Paraffinblöcke entsprechend dieser markierten Folien aus dem Archiv abgerufen. Ein schneller Vergleich zwischen Block und Schieber gemacht. Mit einer halbautomatischen oder hausgemachte Gewebe Arrayer wird die Spenderblock im Kostenvoran Region von Interesse ausgestanzt und in einen Empfänger TMA Block übertragen. Konstruktion von TMA mit diesen Anordnungsverfahren ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig, ungenau und unflexibel. Vorbereiten einer TMA von 475 Stellen in 3 Kopien wird auf etwa 84 Stunden Arbeit. Planung und Design (oder Beratung), die digitale Pathologie kombiniert mit Know-how in der Histologie und automatisierte TMA Anordnen 12: Ein neuer Ansatz für den Bau von TMA wurde kürzlich durch das Institut für Pathologie der Universität Bern, die auf drei Komponenten beruht eingeführt. Gemeinsam wird dieses Konzept genannt nächste Generation Tissue Microarray (ngTMA). Im Folgenden wird ein Protokoll für ngTMA basierend auf dem Beispiel der 134 Patienten mit metastasiertem kolorektalem Karzinom beschrieben. Hier Primärtumoren sowie Lymphknotenmetastasen und Lebermetastasen sind in ngTMAs für nachfolgende Biomarker-Analyse angeordnet werden. Zusätzlich werden kleine Gewebekerne von jedem Patienten für zukünftige Nukleinsäureextraktion gewünscht.

<table><tbody><tr><td>Pannoramic 250 Flash II</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Slide scanner</td></tr><tr><td>TMA Grandmaster</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Tissue Microarrayer</td></tr><tr><td>Pannoramic Viewer</td><td>3DHistech</td><td>free</td><td>Slide viewing software</td></tr><tr><td>Case Center</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Digital slide platform</td></tr></tbody></table>

a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies

Biomarker-Forschung setzt auf Tissue Microarrays (TMA). TMA durch wiederholte Übertragung von kleinen Gewebekernen aus einem &quot;Spender&quot;-Block in eine &quot;Empfänger&quot;-Block erzeugt und dann für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet Biomarker. Die Konstruktion von herkömmlichen TMA ist arbeitsintensiv, ungenau und zeitaufwendig. Hier wird ein Protokoll mit der nächsten Generation Tissue Microarrays (ngTMA) skizziert. ngTMA auf TMA Planung und Design, digitale Pathologie und automatisierte Gewebemikroarray-basierte. Das Protokoll wird am Beispiel von 134 Patienten mit metastasiertem Kolorektalkarzinom dargestellt. Histologischen, statistische und logistische Aspekte berücksichtigt werden, wie der Gewebetyp, spezifische histologische Regionen und Zelltypen für die Aufnahme in der TMA die Anzahl von Gewebeflecken, Probengröße, statistische Analyse, die Anzahl der Kopien TMA. Histologischen Präparaten für jeden Patienten abgetastet und auf einem Web-basierten digitalen Plattform hochgeladen. Dort werden sie angezeigt und annotated (markiert) mit einem 0,6-2,0 mm Durchmesser Werkzeug, mehrere Male mit verschiedenen Farben, um Gewebebereiche zu unterscheiden. Spenderblöcke und 12 &quot;Empfänger&quot;-Blöcke in das Gerät geladen. Digitale Folien werden abgerufen und an Spenderblock Bilder abgestimmt. Wiederholt Anordnungs von kommentierten Regionen wird automatisch durchgeführt, was zu einer ngTMA. In diesem Beispiel sind sechs ngTMAs geplant, die sechs verschiedenen Gewebetypen / histologische Zonen. Zwei Kopien der ngTMAs sind erwünscht. Drei bis vier Schieber für jeden Patienten abgetastet werden; 3 Scan-Durchläufe nötig sind und über Nacht durchgeführt. Alle Folien sind kommentiert; verschiedenen Farben werden verwendet, um die verschiedenen Gewebe / Zonen, nämlich Tumorzentrum, Invasionsfront, Tumor / Stroma, Lymphknotenmetastasen, Lebermetastasen und Normalgewebe darstellen. 17 Anmerkungen / Fall gemacht werden; Zeit für Annotation 2-3 min / Fall. 12 ngTMAs sind enthalten 4.556 Spots produziert. Anordnen Zeit ist 15-20 Stunden. Aufgrund seiner Präzision, Flexibilität und Geschwindigkeit, ist ein leistungsfähiges ngTMAWerkzeug, um die Qualität der TMAs weiter zu verbessern in der klinischen und translationalen Forschung.

Planung und Design Hier das Beispiel von 134 Patienten mit metastasiertem kolorektalem Karzinom, die für eine bestimmte Reihe von Biomarker untersucht werden, verwendet. Nicht nur ist ein ngTMA für diese Patienten geplant, aber DNA-Extraktion durch Mutationsanalyse für eine angegebene Gen gefolgt. Während der Planung und Entwurfsphase ngTMA wurden folgende Aspekte entschieden. Von jedem Patienten wird 6 verschiedene histologische Regionen untersucht werden: Tumorzentrum, Tumorinvasionsfront, Bereiche der dichtesten Tumorknospung (Tumor / Stroma-Interaktion), Normalgewebe, Lymphknotenmetastasen und Lebermetastasen. Drei Tumor Spots pro Tumorgewebe Bereich und zwei normalen Gewebe Spots sind in das Projekt (n = 17 Spots pro Patient) aufgenommen werden. Da es ist geplant, dass mehr als 50 Biomarker auf dieser Patientenmaterial untersucht werden können, werden zwei Exemplare des endgültigen ngTMA gewünscht. Aufgrund der möglichen Kleinheit Lymphknoten und distant Metastasen, eine kleine Kerndurchmesser von 0,6 mm für TMA Konstruktion für alle Gewebe gewählt wird. Zusätzlich ist vorgesehen, dass jede Region getrennt angeordnet sein, so dass 6 ngTMAs mit verschiedenen histologischen Bereiche erzeugt werden: ein ngTMA enthaltenden Geweben aus a) Tumorzentrum, B) Invasionsfront, c) Tumorknospung Bereiche d) normales Gewebe , e) Lymphknotenmetastasen und f) Lebermetastasen. Für die TMA-Design mit einem 0,6 mm-Werkzeug wird ein komfortablen Abstand von 0,4 mm zwischen Schläge gewählt werden. Da Auswertung Gewebeflecken in langen Reihen und Spalten ist oft lästig, werden zwei Ausführungen gewählt. Für die Tumorblöcke mit 3 Schlägen pro Gewebebereich wird ein Design mit sechs Teile angelegt. Dies führt zu einer Gesamtzahl von 402 Schlägen Gewebe. Für normales Gewebe Schläge, Schläge sind 2 pro Fall einbezogen werden. Ein Layout passend 432 Schläge insgesamt gewählt wird. Außerdem, für jeden Fall bis zu 4Kerne mit 0,6 mm wird zusätzlich ausgestanzt und in 0,2-ml-Röhrchen platziert werden. Diese Gewebekernen wird auch kommentiert werden. Zusammenfassend wird 6 ngTMAs verschiedener Gewebe produziert werden (5 x 3 Arrays Tumor Schläge x 134 Patienten; 1 Normalgewebe Array x 2 Schläge x 134 Patienten) zusätzlich zu 4 Kerne pro Patient für Rohre. Zusammengenommen wird 2814 Anmerkungen gemacht werden. Als nächstes werden die entsprechenden H &amp; E Folien aus ausgewählten Patienten aus der Folie Archiv. Jeder Fall wird kurz von einem Pathologen überprüft und repräsentativsten Dias von jedem Gewebetyp ausgewählt werden. Scannen Digitale Folien jeder histologischen Schnitt sind für zukünftige Annotation gemacht. Für diese Studie sind 3-4 Gewebeschnitten, die pro Fall, dh, primäre Darmkrebs gescannt werden, mit oder ohne Normalgewebe, Lymphknotenmetastasen und Lebermetastasen und möglicherweise eine zusätzliche Rutsche conTaining normalen Schleimhaut. Bis zu 10 verschiedene Magazine können vollständig in die Dia-Scanner eingelegt werden; daher 250 gleitet in einem einzigen Durchlauf abgetastet werden. Zeit zum Abtasten und digitale Foliengröße variiert mit den Abmessungen des Gewebes und der gewünschten Qualitätsfaktor. Der Qualitätsfaktor reicht von 0 bis 100. Hier wird ein Qualitätsfaktor von 60 gewählt, da sie eine geringere Scandateigröße produziert ohne spürbaren Verlust von Scan-Qualität. Kleine Biopsien in weniger als 30 s abgetastet werden, wobei ganze Gewebeschnitte, wie die, die in diesem Beispiel verwendet wird, kann zwischen 2 und 10 min dauern. Digitale Dia-Größe kann auch im Bereich von 2 MB bis 2 GB. Mit Hilfe eines Qualitätsfaktor von 60, scannt zwischen 600 MB und 1 GB hergestellt. Zwischen 402 und 536 Objektträger werden für dieses Projekt in Höhe von 3 Scanläufe erforderlich. Jeder Lauf wird über Nacht durchgeführt. Ca. 500 GB Speicherplatz benötigt wird. Die Objektträger werden direkt auf eine digitale Plattform namens Fall Zentrum gescannt (ngtma.unibe.pathcasecenter). Fall Center ist von überall zugänglich mit Internet-Zugang durch Eingabe der benannten Benutzername und Passwort. Anmerkung Für Anmerkungen, sollten zwei Aspekte berücksichtigt werden: 1) verschiedene Gewebebereiche sollten verschiedene Farben Annotation gegeben werden und 2) die Anzahl der Anmerkungen sollte die Anzahl der gewünschten Kopien des endgültigen ngTMA zu reflektieren. In diesem Fall haben 3 Punkte pro Tumorbereich für eine einzelne Kopie ausgewählt. Für 2 Kopien, muss jede Region mit 6 Spots annotiert werden. Nützlich sind grün für normale Gewebe, blau für die Tumorzentrum, gelb für die Tumorinvasionsfront, rot für Bereiche Tumorknospung (Tumor / Stroma) Interaktion, schwarz für Lymphknotenmetastasen, türkis für Fernmetastasen und schließlich weiß für Regionen zu sein für Rohre verwendet. Annotation von jeweils 2-3 Minuten benötigt. ngTMA Bau Diese Studie benötigt 6 ngTMA Blöcke to in 2 Kopien aufgebaut werden, was in 12 abschließenden Blöcken. Die maximale Anzahl der Empfänger, die durch die Blöcke Arrayer unterstützt werden kann, ist 12. Jede Tumor Block 402 Gewebe Spots beinhalten und jedes normale Gewebe Block 268 Spots, in Höhe von insgesamt 4.556 Spots im gesamten Projekt enthalten. Ein TMA Layout wird für jeden Empfänger Block erstellt, und das Projekt wird gespeichert (6A, 6B). 60 Gewebeblöcke in das Gewebe Microarray parallel geladen werden; ein Bild von jedem Spender Block genommen wird. Beginnend mit dem ersten Spenderblock, wird der entsprechende kommentierte digitale Dia von Case-Center abgerufen werden. Slide Anpassung durchgeführt, die zwischen 1-3 Minuten dauern kann. Anmerkungen werden bestätigt und die Arrayer wird aufgefordert, beginnen Stanzen (Abbildung 7). Kern Stanz-und Transferzeit beträgt etwa 12 Sekunden. Verlust der Kerne während dieses Verfahrens ist gering. Gesamtzeit zum Ordnen dieses Projekt beträgt etwa 24 Stunden, einschließlich der Zeit für slide / Block-Matching und Nachladen des Instruments. Einige Beispiele für ngTMA sind in 8A dargestellt. Kerne für die nachfolgende molekulare Analyse kann auch zu diesem Zeitpunkt (8B) ausgestanzt werden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. a) Ein &quot;Spender&quot;-Block. Kerne aus dem Spenderblock ausgestanzt und in B) einen Empfänger Block oder Tissue Microarray (TMA) übertragen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Die herkömmliche Tissue Microarray-Workflow. A) histologischen Präparaten aus dem Archiv abgerufen und B) an den Pathologen f gegeben<html> oder Bewertung. CD) Anmerkungen werden auf den Folien, die den &quot;geschätzten&quot; Region für die Übertragung aus E.) Die entsprechenden Gewebeblöcke abgerufen werden. F) Block und Rutsche für passenden Vergleich, der G kann), manchmal eine schwierige Aufgabe sein. HJ ) Gewebemikroarray dann stattfindet. K) Kerne werden immer wieder übergeben und L) eine endgültige TMA aufgebaut ist. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. a) bis zu 25 Dias in jedem Magazin für das Scannen. B) Anpassung der Qualitätsfaktor gesetzt und Größe hergestellt werden können. Scanfortschritt überwacht werden kann. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Abbildung 4. A) gescannten Dias können auf die web-basierte Plattform, Fall Center. B) Digitale Folien angezeigt werden können hochgeladen werden. Die TMA-Annotation Tool ermöglicht dem Benutzer, die Kerngröße und Farbe für Annotation. C erforderlich) Anmerkungen können direkt auf die digitale Folie platziert werden soll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. a) bis zu 60 Blöcke in das Gewebe Microarray, nämlich 10 Spenderblöcke pro Zeile und 12 Empfänger Blöcken sowie B) Ein Bild von jedem Spender-Block. Geladen werden können, wird genommen, die digital Schieber abgerufen. Abstimmung von Block und Rutsche ist getan und Anmerkungen werden für Block Stanzen. C) Der Fortschritt der Anordnungs kann überwacht werden, während das Gerät Stanzen. D) nach dem Stanzen durchgeführt wird, ein Export der Standort jeder Stelle im Layout, aber auch ein Bild von jedem Spender Block mit entsprechenden Anmerkungen gemacht. <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6. Diese TMA-Layouts wurden Anordnen der A) Tumorblöcke und B) normalen Geweben verwendet. <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500" /> Abbildung 7. Screenshot der Microarray-Gewebe-Software. Auf der linken Seite, 12 refänger Blöcke können in dem Gerät angeordnet werden. Auf dem Boden, werden die Bilder der einzelnen Spenderblock übernommen. In der Mitte, der TMA-Layout wird der Fortschritt der Stanz sowie vergrößerte Bilder der einzelnen Spenderblock mit Anmerkungen gefunden. <img alt="Figur 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500" /> Abbildung 8. A) Einige Beispiele für neu erstellte ngTMA Blöcke. B) Weitere Schläge Gewebe können für nachfolgende molekulare Analyse entnommen werden. Diese Kerne ausgestanzt und in 0,2 ml-Röhrchen gegeben. <img alt="Figur 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600" /> Abbildung 9. Beispiele für ngTMA Biomarker-Anwendungen. A) Immunhistochemie-Färbung von Ki67 in der Darmkrebs. Dual HER2 Immunhistochemie / in situ-Hybridisierungsassay, welches B) geringe Expression des Proteins (braun) und keine Amplifikation des HER2-Gens (schwarz) relativ zu dem Zentromer (rot), c) eine hohe Expression des Proteins (braun) und HER2-Genamplifikation ( schwarz), bezogen auf Zentromer (rot). D) Chromogene in situ Hybridisierung Her2 single mRNA-Transkripte in der Brustkrebs ngTMA. E) Immunhistochemie für CD8 in Darmkrebs. F) Doppel Immunhistochemie-Färbung für pan-Zytokeratin-Marker AE1 / AE3 (braun, Tumorzellen) und CD68 (rot;. Makrophagen) Hervorhebung Tumor-Mikroumgebung in der Darmkrebs <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Das Protokoll zielt auf die Optimierung der Konstruktion und Qualität der Gewebe-Mikroarrays für Biomarker-Forschung. Es umfasst Aspekte der Planung und Design, digitale Pathologie, virtuellen Schiebe Anmerkungen und automatisierte Gewebeanordnungs.

Eine Next-Generation Tissue Microarray (ngTMA) Protokoll zur Biomarker-Studien

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

23.9K Aufrufe.  University of Bern.  Das Protokoll zielt auf die Optimierung der Konstruktion und Qualität der Gewebe-Mikroarrays für Biomarker-Forschung. Es umfasst Aspekte der Planung und Design, digitale Pathologie, virtuellen Schiebe Anmerkungen und automatisierte Gewebeanordnungs. 

Serie: A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Manual Construction of a Tissue Microarray using the Tape Method and a Handheld Microarrayer

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single paraffin block. This is achieved by using tissue cores extracted from the region of interest of different donor FFPE blocks and arranging them into a single TMA paraffin block. Once constructed, sections from the completed TMA can be used to perform immunohistochemistry, chromogenic, fluorescence in situ hybridization (FISH) and RNA ISH studies to assess protein expression as well as genomic and transcriptional alterations in many samples simultaneously, thus minimizing tissue usage and reducing reagent costs. There are several different TMA construction techniques. One of the most common construction methods is the recipient method, which works best with cores of the same length for which a minimum length of 4 mm is recommended. Unfortunately, tissue blocks can be heavily resected during the diagnostic process, frequently resulting in "non-ideal" donor block thicknesses of less than 4 mm. The current article and video focus on the double-sided adhesive tape method; an alternative manual, low cost, easy to use, and rapid method to construct low density (&lt;50 cores) TMAs that is highly compatible with these non-ideal donor blocks. This protocol provides a step-by-step guide on how to construct a TMA using this method, with a focus on the critical importance of pathological review and post construction validation.

This protocol outlines the tape method on how to manually construct a tissue microarray using FFPE donor blocks of differing depths.

Manueller Aufbau eines Gewebe-Microarrays mit der Tape-Methode und einem Handheld-Microarrayer

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single ...

Forschung

Krebsforschung

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically complex tumors, with a high degree of proteomic variability across both the tumor itself and its heterogenous microenvironment. The malignant potential of these tumors is enhanced by the dysregulation of proteins involved in several key pathways, including processes that maintain cellular stability and preserve the structural integrity of the microenvironment. Although there have been numerous bulk and single-cell glioma analyses, there is a relative paucity of spatial stratification of these proteomic data. Understanding differences in spatial distribution of tumorigenic factors and immune cell populations between the intrinsic tumor, invasive edge, and microenvironment offers valuable insight into the mechanisms underlying tumor proliferation and propagation. Digital spatial profiling (DSP) represents a powerful technology that can form the foundation for these important multilayer analyses.
DSP is a method that efficiently quantifies protein expression within user-specified spatial regions in a tissue specimen. DSP is ideal for studying the differential expression of multiple proteins within and across regions of distinction, enabling multiple levels of quantitative and qualitative analysis. The DSP protocol is systematic and user-friendly, allowing for customized spatial analysis of proteomic data. In this experiment, tissue microarrays are constructed from archived glioblastoma core biopsies. Next, a panel of antibodies is selected, targeting proteins of interest within the sample. The antibodies, which are preconjugated to UV-photocleavable DNA oligonucleotides, are then incubated with the tissue sample overnight. Under fluorescence microscopy visualization of the antibodies, regions of interest (ROIs) within which to quantify protein expression are defined with the samples. UV light is then directed at each ROI, cleaving the DNA oligonucleotides. The oligonucleotides are microaspirated and counted within each ROI, quantifying the corresponding protein on a spatial basis.

Proteomic dysregulation plays an important role in the spread of diffusely infiltrating gliomas, but several relevant proteins remain unidentified. Digital spatial processing (DSP) offers an efficient, high-throughput approach for characterizing the differential expression of candidate proteins that may contribute to the invasion and migration of infiltrative gliomas.

Digitales räumliches Profiling zur Charakterisierung der Mikroumgebung bei diffus infiltrierenden Gliomen im Erwachsenentyp

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Biotechnik

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

Optimierung eines Multiplex-RNA-basierten Ausdruck-Assays mit Brust-Krebs-Archivmaterial

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast cancers. However, a minority of cases displays a heterogeneous distribution of HER2-positive cells, which generates major clinical challenges. To date, no reliable and standardized protocols for the characterization and quantification of HER2 heterogeneous gene amplification in large cohorts have been proposed. Here, we present a high-throughput methodology to simultaneously assess the HER2 status across different topographic areas of multiple breast cancers. In particular, we illustrate the laboratory procedure to construct enhanced tissue microarrays (TMAs) incorporating a targeted mapping of the tumors. All TMA parameters have been specifically optimized for the silver in situ hybridization (SISH) of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) breast tissues. Immunohistochemical analysis of the prognostic and predictive biomarkers (i.e., ER, PR, Ki67, and HER2) should be performed using automated procedures. A customized SISH protocol has been implemented to allow a high-quality molecular analysis across multiple tissues that underwent different fixation, processing, and storage procedures. In this study, we provide a proof-of-principle that specific DNA sequences could be localized simultaneously in distinct topographic areas of multiple and heterogeneously processed breast cancers using an efficient and cost-effective method.

Heterogeneous distribution of HER2-positive cells can be observed in a subset of breast cancers and generates clinical dilemmas. Here, we introduce a reliable and cost-effective protocol to define, quantify, and compare HER2 intra-tumor genetic heterogeneity in a large series of heterogeneously processed breast cancers.

Aufbau einer Hochdurchsatz-Screening-Plattform zu beurteilen, die Heterogenität der HER2-Gene-Verstärkung in Brust-

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

Immunologie und Infektion

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

Herstellung von Tissue Microarrays, Immunhistochemie Färbung und Digitalisierung Innerhalb des Human Protein Atlas

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Biologie

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment response challenging. The ability to resolve the relative populations of immune cells present in and around the tumor tissue has been shown to be clinically-relevant to understanding response, but is limited by traditional techniques such as flow cytometry and immunohistochemistry (IHC), due the large amount of tissue required, lack of accurate cell type markers, and many technical and logistical hurdles. One assay (e.g., the ImmunoPrism Immune Profiling Assay) overcomes these challenges by accommodating both small amounts of RNA and highly degraded RNA, common features of RNA extracted from clinically archived solid tumor tissue. The assay is accessed via a reagent kit and cloud-based informatics that provides an end-to-end quantitative, high-throughput immuno-profiling solution for Illumina sequencing platforms. Researchers start with as few as two sections of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue or 20-40 ng of total RNA (depending on sample quality), and the protocol generates an immune profile report quantifying eight immune cell types and ten immune escape genes, capturing a complete view of the tumor microenvironment. No additional bioinformatic analysis is required to make use of the resulting data. With the appropriate sample cohorts, the protocol may also be used to identify statistically significant biomarkers within a patient population of interest.

The use of an RNA-based approach to determine quantitative immune profiles of solid tumor tissues and leverage clinical cohorts for immune-oncology biomarker discovery is described through a molecular and informatics protocols.

Predictive Immune Modeling von Solid Tumoren

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

Spot the Correct Tissue Every Time in Multi-Gewebe-Blöcke

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Herstellung von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe Cores sowohl für RNA und DNA-Extraktion

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...