Die Autoren danken den technischen Mitarbeitern des Translational Research Unit; Mary Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni und die Informatik-Team am Institut für Pathologie der Universität Bern.

HINWEIS: Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Inselspital, Bern, Schweiz (07-10-13) genehmigt worden. Gewebe wurden von der Tumorbank Bern, Institut für Pathologie der Universität Bern erhalten. 1. Planung und Design (Consulting) <ol><li> Denken Sie über die Forschungsfrage beantwortet werden. Entscheiden Sie sich für den Gewebetypen, die in das Projekt einbezogen werden. Bestimmen Sie, was histologische Strukturen sind wichtig, um die Frage zu beantworten. </li><li> Festzustellen, die die nützlichsten Kerndurchmesser und die Anzahl der Kerne pro Patient für das Projekt. Entscheidet über die Anzahl der Kopien der nächsten Generation Tissue Micro Array (ngTMA) bezogen auf die Menge der Biomarker zu untersuchen. </li><li> Betrachten statistische Aspekte wie Stichprobengröße und-Analyse nach der Tissue Microarray (TMA) aufgebaut ist. Bestimmen Sie die Anzahl der Patienten, für die Aufnahme in die Studie und zu etablieren Kontrollgeweben für das Array. </li><li> Rufen Sie die histologische (oderDiagnose) Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Dias von jedem Patienten. Kurz die Dias und bestimmen Sie diejenigen, die relevante Informationen und Histologie für das Projekt. HINWEIS: Stellen Sie neue Abschnitte der Paraffinblöcke, wenn besondere Flecken oder Immunhistochemie Schlitten für Dias Scannen und Annotation gewünscht, anstelle von H &amp; E Dias </li></ol> 2. Schieben Scanning <ol><li> Schalten Sie PC und Dia-Scanner und Scan-Software geöffnet. Wählen Sie &quot;Automatik-Modus&quot; für Hellfeld Scannen von der Vorschau-Bildschirm. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Scan-Optionen&quot;, um die Diashow Qualitätsparameter einzustellen. Zu diesem Zeitpunkt wählen, ob Träger werden direkt auf die digitale Plattform von Internet oder auf einem lokalen Laufwerk (oder externes Laufwerk) zugänglich gescannt werden und stellen die Arten des Scannens und der Anzahl der Schwerpunkte. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Server-Parameter&quot;, um zum &quot;Case-Center&quot; zu scannen. In diesem Schritt fügen Sie mehr Zeitschriften, beschriften alle Folien und setzender Ordner in der Rechtssache Center, wo die Folien gespeichert werden sollen. Jedes Magazin kann bis zu 25 Dias. </li><li> Überprüfen Sie die Qualität / Sauberkeit tatsächlichen histologischen Präparaten für das Scannen. Falls notwendig, reinigen Folien mit 70% Ethanol. </li><li> Legen Sie bis zu 25 Objektträger pro Magazin mit dem nach innen weisenden Etiketten (3A) </li><li> Legen Sie das Magazin in den Scanner. Für mehr als ein Magazin, legen Sie sie auf der jeweils anderen. </li><li> Dia scannen, indem Sie auf den grünen Pfeil (3B). Wenn alle Objektträger gescannt werden, entladen die Zeitschriften und schloss das Programm ab, PC und Dia-Scanner. </li></ol> 3. Digital Slide Annotation <ol><li> Geben Sie die Browser-Adress für digitale Dia-Management-Center und laden Sie die kostenlose digitale Dia-Viewer-Software. </li><li> Öffnen Sie die digitale Dia-Viewer-Software und wählen Sie den Ordner mit den digitalen Objektträger (4A). </li><li> Notizen hinzufügen, neu anordnen und verwalten die digital Dia-Ordner oder Benutzerrechte vergeben, um Kollegen oder Anlagen hinzufügen zu dem Ordner. </li><li> Klicken Sie auf die gewünschte digitale Dia in der digitalen Dia-Betrachter angezeigt. </li><li> Mit Hilfe der Vergrößerungswerkzeug, bewerten Sie die Folie und finden Sie die Gegenden für die Integration in die ngTMA. </li><li> Mit dem &#39;TMA Anmerkungswerkzeug &quot;, wählen Sie die Größe des gewünschten Kern und die Farbe der Annotation. Legen Sie die Anmerkung auf der digitalen Dia indem Sie darauf klicken (Abbildung 4B). </li><li> Bewegen Sie die Annotation zu den gewünschten histologischen Strukturen zur Einführung in das ngTMA (4C). </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang der Annotation wieder mit Hilfe der Anmerkungswerkzeug, die Auswahl einer Kerngröße und einer gewünschten Annotation Farbe. Wiederholen Sie den Schiebe Betrachtung und Kommentierung auf allen Folien im Ordner. </li><li> Alternativ legen Gewebe Kerne für die PCR in 0,2-ml-Röhrchen statt Integration in die TMA. Anmerkungen versehen Folien mit einer anderen Farbe zu identifizierenDiese Spots für weitere molekulare Analyse. </li><li> Erstellen Sie eine Liste aller Fälle mit den entsprechenden Anmerkungen und Farben. </li></ol> 4. Tissue Microarray Bau <ol><li> Rufen Sie die entsprechenden Paraffingewebeblöcke für alle digitalen kommentierte Dias, sortieren Blöcke in der gewünschten Reihenfolge für die Gewebemikroarray. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Gewebeblöcke haben ein Minimum von 4 mm Dicke. Wenn nicht, ist Rückbettung von Gewebe notwendig. </li><li> Schalten Sie den PC &quot;ON&quot; und automatisierte Gewebemicroarray-Instrument. Öffnen Sie das Gewebe Microarray-Software und geben Sie einen Namen für das Projekt </li><li> Führen Sie einen &quot;Werkzeugwechsel&quot;, und wählen Sie die gewünschte Werkzeugdurchmesser für das Projekt (dh 0,6, 1,0, 1,5 oder 2,0 mm). </li><li> Legen Sie bis zu 12 &quot;Empfänger&quot; TMA-Blöcke in die Maschine. Geben eine ID zu jedem der 12 Blöcke </li><li> Erstellen Sie eine TMA-Layout für jede Empfängerblock. Beobachten Sie eine TMA-Design mit der Anzahl der Zeilen, Spalten und zuvorkommeny-Linien sowie Abstand zwischen den Kernen. Ein neues Layout für die einzelnen Empfängerblock oder verwenden Sie das gleiche Layout wiederholt. </li><li> Platzieren Sie den Cursor auf dem Empfängerblock-Layout, um die ersten Kern nehmen. </li><li> Als nächstes laden bis zu 60 Spenderblöcke in das Gewebe Microarray (5A). Zeigen zehn Blöcke in jeder Zeile von A bis F. Geben Sie jedem Block ein Spender ID. Bilder von jeder Spenderblock beobachten auf dem Computerbildschirm automatisch vom Gewebe Microarray erworben. </li><li> Beginnend mit dem ersten Block, klicken Sie auf &quot;Verschieben&quot;. Beachten Sie die annotierte digitale Dia in der digitalen Dia-Management-Center (oder auf dem externen Laufwerk) gespeichert unter Verwendung der digitalen Dia-Betrachter. Anzeigen des Bildes und des Spenderblocks und die digitale Dia Seite-an-Seite. </li><li> Auswahlreferenzpunkten auf dem Block Bild zu dem Spenderblock Bild mit dem digitalen Objektlagern </li><li> Nach dem Klick auf &quot;Weiter&quot;, beobachten die Anmerkungen auf ein größeres Bild des Blocks. (5B &lt;/ Strong&gt;). Klicken Sie oben auf die Anmerkungen zu bestätigen, und klicken Sie auf &quot;Start&quot;. HINWEIS: Dies fordert das Gewebe Microarray starten ein Loch von 0,6 mm Durchmesser in der Empfängerblock bei der gewählten Ausgangspunkt. Dann in einem zweiten Schritt unter Verwendung des Stanzwerkzeugs, stanzt das Instrument Loch im Gewebe der ausgewählten Spenderblock in der genauen kommentiert und bestätigt Region. Kerne werden dann aus dem Spender auf den Empfänger übertragen Block. </li><li> Nach etwa 500 Kerne, reinigen Sie den Bohrer und Stanzwerkzeug mit einem Putzlappen Xylol. </li><li> Wenn Gewebe Kerne sind erwünscht (eher als Schläge in ein ngTMA), klicken Sie auf den &quot;PCR&quot;-Tool für den Block, bestätigen bis zu 4 Anmerkungen und klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Dies wird Punsch und übertragen Sie die Kerne in einer 0,2-ml-Tube. </li><li> Wiederholen Sie Punkt 4,9-4,11 mit der zweiten Spenderblock, und so weiter. </li><li> Nach der Verwendung alle Spenderblöcke, geben Sie eine zweite Runde der Spenderblöcke (61-120) in das Gewebe-MikroarrayER und weiterhin Schritte 4,8-4,11. </li><li> Aktualisieren Spender und Empfänger Blockbilder während der Projektfortschritt beim Bohren und Stanzen auftritt (Abbildung 5C). </li><li> Führen Sie eine &quot;Export&quot;, nachdem das Projekt abgeschlossen ist. Suchen Sie die Datei mit den .xslx Spender und Empfänger-Block-IDs, die Lokalisierung aller Schläge innerhalb der TMA sowie der TMA-Layout / Design, in der exportierten Ordner. Speichern Sie alle Bilder Spenderblock mit allen überlagert Annotation als jpg-Bilder in der exportierten Ordner (5D). Der letzte Block TMA ist dann bereit. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+tissue+microarrays:+A+novel+and+viable+approach+to+optimising+tissue+micro-arrays+for+biomarker+research+applied+to+Ductal+Carcinoma+in+Situ+(DCIS).">Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS).</a> Histopathology. , 2-8 (2014).</li><li>Torata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+tablet+method:+an+efficient+tissue+banking+procedure+applicable+to+both+molecular+analysis+and+frozen+tissue+microarray.">Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray.</a> Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).</li></ol>

The authors have no disclosures

In diesem Beitrag wird ein Protokoll für ngTMA beschrieben. ngTMA ist ein neu etabliertes Konzept zur Gewebemikroarray mit Planung und Design, digitale Pathologie und Dia-Annotation sowie automatisierte Gewebemikroarray-12. Im Vergleich zu herkömmlichen Gewebemikroarray bietet ngTMA viele Vorteile. In einem ersten Schritt wird die Projektierungsphase kritisch. Der Schwerpunkt liegt auf der Beantwortung einer gezielten Fragestellung. Dies sollte berücksichtigt werden die histologischen Fragen (zB, welche Regionen und wie viele Flecken will ich gehören?), Die statistische Planung (zB Stichprobengröße? Wie kann ich meine Proben später zu analysieren?) Und logistische Überlegungen (zB wie viele Biomarker und daher, wie viele Kopien ngTMA?). Eine spezifische ngTMA wird für die spezifischen Bedürfnisse gemacht, ob es für Biomarker-Screening und High-Throughput-oder, um spezifische histologische Aspekte nur auf ein paar gut ausgewählte cas studierenES. Eine, wenn nicht die, am wichtigsten Nachteil herkömmlicher Gewebemikroarray die geringe Genauigkeit, mit der Markierungen auf den histologischen Objektträgern hergestellt werden. Die histologische Untersuchung spezifischer Strukturen, Zellen oder Bereiche nahezu unmöglich gemacht. ngTMA ermöglicht hohe Genauigkeit, da Anmerkungen direkt auf den digitalen Objektträger platziert. Dies ermöglicht dem Forscher, genau Wählen Sie die Regionen gestanzt werden, einschließlich spezifischer Zellen. In diesem Beispiel sind die verschiedenen Bereiche innerhalb des gleichen Gewebeblock aus zum Ordnen tanzt, wie die Tumorzentrum der Invasionsfront und Bereiche der Tumor / Stroma-Wechselwirkung durch das Vorhandensein von kleinen Tumorzellhaufen oder sogar einzelne Zellen markiert. Diese Genauigkeit kann nur mit ngTMA erreicht werden. Drittens, weil Objektträger werden auf einem Web-basierten digitalen Plattform abgetastet gleiten Ansicht und Kommentierung durch den Computer nicht mit dem Mikroskop durchgeführt werden. Das Gewebe Anordnungs Software bietet eine benutzerfreundlicheSchnittstelle mit einem hohen Grad an Flexibilität und damit verschiedene Layouts und ngTMA Design erreicht werden kann. Da TMA Aufbau wird automatisch durch Bohren durchgeführt wird, gibt es wenig Notwendigkeit für praktische Manövrieren und die Zeit für die Konstruktion erheblich reduziert. Die Zeit für die TMA Bau in diesem Beispiel ist hier zwischen 24 Stunden. Bei Verwendung eines herkömmlichen TMA Ansatz und Schätzen 15 Schläge pro Stunde, wäre dieses Projekt etwa 304 Stunden zu nehmen. ngTMA kann angewendet werden, um Protein-Expression, mRNA oder DNA sowie Kombinationen davon zu untersuchen. 9 veranschaulicht einige dieser Anwendungen potentielle Biomarker. Standard Immunhistochemie angewendet werden, um die Verbreitung von Krebserkrankungen unter Verwendung von Index Ki-67 zu bestimmen. Ein kombinierter Ansatz zur Proteinexpression und DNA-Amplifikation für Gene wie HER2 Untersuchung verwendet werden. Gewebe können auf einem einzigen ngTMA versammelt, um Kosten, Auslastung und anderen Gewebe Ressource zu verringerns. Zusätzlich können chromogene mRNA in situ Hybridisierung für HER2 und andere Gene durchgeführt werden, um einzelne mRNA-Transkripte in einer Vielzahl von Fällen unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Gewebeschnitten zu identifizieren. Immunhistochemie von Immunmarker, wie CD8 können im Rahmen der Tumormikroumgebung dargestellt werden. Doppel Immunhistochemie kann auch verwendet werden, wie Interaktionen zwischen Immunzellen (rot markiert) und Tumorzellen (in braun markiert) an der Invasionsfront von Krebs auf bestimmte Bereiche von Interesse zu markieren. Solch ein Bereich von Interesse nicht unter Verwendung herkömmlicher Gewebemikroarray erfasst haben. Dennoch enthält diese Protokoll einige Einschränkungen. Die wichtigste Herausforderung ist die Überlappung zwischen Donor-Block und digitale Dia. Mehrere Faktoren können diesen Schritt zu beeinflussen. Erstens sollte der letzte Abschnitt des Blocks für Dia Scannen verwendet werden. In vielen Fällen ist das H &amp; E ist nicht der letzte Abschnitt des Spenderblocks, Käther ist es ein immunhistochemischen oder anderen Fleck. In diesem Fall wird auch ein gefärbtes Schieber verwendet werden, solange der letzte Fleck abgetastet und annotiert oder einer neuen H &amp; E vorgenommen werden sollen. Vorsicht ist auch bei der Gewebeschnitte werden gemacht, wie Gewebe können im Wasserbad, die anspruchsvolle Anpassung der Rutsche und Block führt zu erweitern. Zweitens, im Moment Projekte bis 12 Empfänger TMA Blöcke auf einmal verarbeitet beschränkt. Größere Projekte von mehr als 12 TMAs muss zu einer zweiten Projektnamen zugeordnet werden. Drittens müssen die Spenderblöcke mit Standard-Formen und-Kassetten als das Instrument kann sich nicht auf verschiedene Größen einstellen werden. Schließlich müssen die Spenderblöcke minimale Höhe (4 mm), um eine optimale Bohrung erzielen überschreiten. In einigen Fällen erfordert dies Rückbettung von Geweben. Hunderte von Publikationen in den letzten Jahren unterstreichen die TMA als ein unschätzbares Werkzeug für Biomarker-Forschung. TMAs wurden verwendet, um Lungen 13, kolorektalen 7, bre studierenAST 14, 15 Prostata, Pankreas 16, der Blase 17 und Magenkrebs 18, um nur einige zu nennen. Eine zunehmende Anzahl von Autoren haben die Verwendung von TMA mit Bildanalyse und bedeutende Schritte werden in dieser Richtung gemacht 19-21 zusammengefasst. Doch neben einer Handvoll von Forschungsgruppen, die innovative Ideen TMA 22-24 veröffentlicht haben, wenig Aufmerksamkeit gegeben worden, um die TMA-Technik selbst zu optimieren. Automatisierte Gewebe Microarrayer, wie der ATA-27 um Estigen / Beecher tun geben Layout-Design und zweckmäßige und automatisierte Gewebe Stanzen. Dies stellt jedoch nur ein Aspekt der ngTMA Konzept. ngTMA ist eine wesentliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Gewebemikroarray-Techniken. Es enthält Fachwissen in der Histologie und TMA-Design mit der Flexibilität der digitalen Pathologie und der Genauigkeit der digitalen Anmerkungen mit der Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit des automatischen TMA Konstruktion. Die Kombination NGTMA und Bildanalyse zur Auswertung von Protein und molekulare Biomarker wird ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Qualität der klinischen und translationalen Forschung in der Zukunft weiter zu verbessern.

In den letzten zwei Jahrzehnten haben Tissue Microarrays (TMA) einen bemerkenswerten Einfluss auf die Biomarker-Untersuchung Studien hatten. TMAs sind im wesentlichen Gewebe &quot;Archive&quot; durch die wiederholte Übertragung von kleinen Gewebekerne, in der Regel in einer Größe von 0,6 bis 2,0 mm Durchmesser hergestellt, aus Paraffin eingebettet &quot;Spender&quot;-Blöcke in einem einzigen TMA &quot;Empfänger&quot;-Block (Abbildung 1) 1. Mit einem kleinen Kerngröße, können etwa 500 verschiedene Gewebeflecken aus wenige oder viele verschiedene Patienten in einen TMA 2 angeordnet werden. Die Verwendung von TMA für prognostische oder prädiktive Biomarkerstudien hat viele Vorteile. Man betrachte das Beispiel, wo die Expression eines Proteins Biomarker durch Immunhistochemie ist an 450 Patienten ausgewertet. Anstatt der Durchführung 450 immunhistochemische Färbungen auf 450 Patienten Folien aus der gleichen Anzahl von Blöcken unterteilt, können kleine Kerne von jeder Probe auf einem einzigen T angeordnet werden,MA-Block. Auch wenn mehrere Kerne werden von jedem einzelnen Patienten entnommen werden eine minimale Anzahl von Blöcken erzeugt. Das hat den erheblichen Einfluss von Kosten und anderen Ressourcen drastisch abnehm sowie die Verringerung Gewebe Verschwendung. Zusätzlich ermöglicht dies angemessen versorgt Studien unter Verwendung einer großen Anzahl von Geweben unter den gleichen experimentellen Bedingungen ausgewertet werden. TMAs haben viele verschiedene Anwendungen. Zum Beispiel können sie verwendet werden, um die Morphologie, Proteinexpression, RNA-Expression und DNA-Aberrationen folgenden Färbung mit verschiedenen Farbstoffen zu untersuchen, oder nach Immunhistochemie oder chromogene und selbst Fluoreszenz in situ Hybridisierung 3-7. Jüngste Studien haben auch den inner TMAs und Ring Variation in Färbeprotokollen testen, stellen Spezifität oder Sensitivität von Antikörpern für bestimmte Gen-Mutationen und die Interobserver Reproduzierbarkeit der Proteinexpression in internationalen Kooperationen bestimmen <sup&gt; 8-11. Der Bau der traditionellen TMAs mit Patienten stammenden Gewebe ist eine lange Mehrschritt-Verfahren (Abbildung 2). Es beginnt mit der Suche nach möglichen geeigneten Fällen und Auswahl von Diagnose Dias aus dem Archiv in einem Institut für Pathologie, oder andere Institut, von wo sie abgerufen werden. Der Pathologe beurteilt die Folie pro Fall und wählt die Vertreter Rutsche für die Zwecke der Studie. Als nächstes wird der interessierende Bereich mit einem Stift unter dem Mikroskop direkt markiert. Dies ist oft schwierig und ungenau und führt nur zu einer &quot;Schätzung&quot;, wo Gewebe Schläge vorgenommen werden soll. Danach werden die Paraffinblöcke entsprechend dieser markierten Folien aus dem Archiv abgerufen. Ein schneller Vergleich zwischen Block und Schieber gemacht. Mit einer halbautomatischen oder hausgemachte Gewebe Arrayer wird die Spenderblock im Kostenvoran Region von Interesse ausgestanzt und in einen Empfänger TMA Block übertragen. Konstruktion von TMA mit diesen Anordnungsverfahren ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig, ungenau und unflexibel. Vorbereiten einer TMA von 475 Stellen in 3 Kopien wird auf etwa 84 Stunden Arbeit. Planung und Design (oder Beratung), die digitale Pathologie kombiniert mit Know-how in der Histologie und automatisierte TMA Anordnen 12: Ein neuer Ansatz für den Bau von TMA wurde kürzlich durch das Institut für Pathologie der Universität Bern, die auf drei Komponenten beruht eingeführt. Gemeinsam wird dieses Konzept genannt nächste Generation Tissue Microarray (ngTMA). Im Folgenden wird ein Protokoll für ngTMA basierend auf dem Beispiel der 134 Patienten mit metastasiertem kolorektalem Karzinom beschrieben. Hier Primärtumoren sowie Lymphknotenmetastasen und Lebermetastasen sind in ngTMAs für nachfolgende Biomarker-Analyse angeordnet werden. Zusätzlich werden kleine Gewebekerne von jedem Patienten für zukünftige Nukleinsäureextraktion gewünscht.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Pannoramic 250 Flash II</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Slide scanner</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">TMA Grandmaster</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tissue Microarrayer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Pannoramic Viewer</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;">free</td>
			<td>Slide viewing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Case Center</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digital slide platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies

Biomarker-Forschung setzt auf Tissue Microarrays (TMA). TMA durch wiederholte Übertragung von kleinen Gewebekernen aus einem &quot;Spender&quot;-Block in eine &quot;Empfänger&quot;-Block erzeugt und dann für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet Biomarker. Die Konstruktion von herkömmlichen TMA ist arbeitsintensiv, ungenau und zeitaufwendig. Hier wird ein Protokoll mit der nächsten Generation Tissue Microarrays (ngTMA) skizziert. ngTMA auf TMA Planung und Design, digitale Pathologie und automatisierte Gewebemikroarray-basierte. Das Protokoll wird am Beispiel von 134 Patienten mit metastasiertem Kolorektalkarzinom dargestellt. Histologischen, statistische und logistische Aspekte berücksichtigt werden, wie der Gewebetyp, spezifische histologische Regionen und Zelltypen für die Aufnahme in der TMA die Anzahl von Gewebeflecken, Probengröße, statistische Analyse, die Anzahl der Kopien TMA. Histologischen Präparaten für jeden Patienten abgetastet und auf einem Web-basierten digitalen Plattform hochgeladen. Dort werden sie angezeigt und annotated (markiert) mit einem 0,6-2,0 mm Durchmesser Werkzeug, mehrere Male mit verschiedenen Farben, um Gewebebereiche zu unterscheiden. Spenderblöcke und 12 &quot;Empfänger&quot;-Blöcke in das Gerät geladen. Digitale Folien werden abgerufen und an Spenderblock Bilder abgestimmt. Wiederholt Anordnungs von kommentierten Regionen wird automatisch durchgeführt, was zu einer ngTMA. In diesem Beispiel sind sechs ngTMAs geplant, die sechs verschiedenen Gewebetypen / histologische Zonen. Zwei Kopien der ngTMAs sind erwünscht. Drei bis vier Schieber für jeden Patienten abgetastet werden; 3 Scan-Durchläufe nötig sind und über Nacht durchgeführt. Alle Folien sind kommentiert; verschiedenen Farben werden verwendet, um die verschiedenen Gewebe / Zonen, nämlich Tumorzentrum, Invasionsfront, Tumor / Stroma, Lymphknotenmetastasen, Lebermetastasen und Normalgewebe darstellen. 17 Anmerkungen / Fall gemacht werden; Zeit für Annotation 2-3 min / Fall. 12 ngTMAs sind enthalten 4.556 Spots produziert. Anordnen Zeit ist 15-20 Stunden. Aufgrund seiner Präzision, Flexibilität und Geschwindigkeit, ist ein leistungsfähiges ngTMAWerkzeug, um die Qualität der TMAs weiter zu verbessern in der klinischen und translationalen Forschung.

Planung und Design Hier das Beispiel von 134 Patienten mit metastasiertem kolorektalem Karzinom, die für eine bestimmte Reihe von Biomarker untersucht werden, verwendet. Nicht nur ist ein ngTMA für diese Patienten geplant, aber DNA-Extraktion durch Mutationsanalyse für eine angegebene Gen gefolgt. Während der Planung und Entwurfsphase ngTMA wurden folgende Aspekte entschieden. Von jedem Patienten wird 6 verschiedene histologische Regionen untersucht werden: Tumorzentrum, Tumorinvasionsfront, Bereiche der dichtesten Tumorknospung (Tumor / Stroma-Interaktion), Normalgewebe, Lymphknotenmetastasen und Lebermetastasen. Drei Tumor Spots pro Tumorgewebe Bereich und zwei normalen Gewebe Spots sind in das Projekt (n = 17 Spots pro Patient) aufgenommen werden. Da es ist geplant, dass mehr als 50 Biomarker auf dieser Patientenmaterial untersucht werden können, werden zwei Exemplare des endgültigen ngTMA gewünscht. Aufgrund der möglichen Kleinheit Lymphknoten und distant Metastasen, eine kleine Kerndurchmesser von 0,6 mm für TMA Konstruktion für alle Gewebe gewählt wird. Zusätzlich ist vorgesehen, dass jede Region getrennt angeordnet sein, so dass 6 ngTMAs mit verschiedenen histologischen Bereiche erzeugt werden: ein ngTMA enthaltenden Geweben aus a) Tumorzentrum, B) Invasionsfront, c) Tumorknospung Bereiche d) normales Gewebe , e) Lymphknotenmetastasen und f) Lebermetastasen. Für die TMA-Design mit einem 0,6 mm-Werkzeug wird ein komfortablen Abstand von 0,4 mm zwischen Schläge gewählt werden. Da Auswertung Gewebeflecken in langen Reihen und Spalten ist oft lästig, werden zwei Ausführungen gewählt. Für die Tumorblöcke mit 3 Schlägen pro Gewebebereich wird ein Design mit sechs Teile angelegt. Dies führt zu einer Gesamtzahl von 402 Schlägen Gewebe. Für normales Gewebe Schläge, Schläge sind 2 pro Fall einbezogen werden. Ein Layout passend 432 Schläge insgesamt gewählt wird. Außerdem, für jeden Fall bis zu 4Kerne mit 0,6 mm wird zusätzlich ausgestanzt und in 0,2-ml-Röhrchen platziert werden. Diese Gewebekernen wird auch kommentiert werden. Zusammenfassend wird 6 ngTMAs verschiedener Gewebe produziert werden (5 x 3 Arrays Tumor Schläge x 134 Patienten; 1 Normalgewebe Array x 2 Schläge x 134 Patienten) zusätzlich zu 4 Kerne pro Patient für Rohre. Zusammengenommen wird 2814 Anmerkungen gemacht werden. Als nächstes werden die entsprechenden H &amp; E Folien aus ausgewählten Patienten aus der Folie Archiv. Jeder Fall wird kurz von einem Pathologen überprüft und repräsentativsten Dias von jedem Gewebetyp ausgewählt werden. Scannen Digitale Folien jeder histologischen Schnitt sind für zukünftige Annotation gemacht. Für diese Studie sind 3-4 Gewebeschnitten, die pro Fall, dh, primäre Darmkrebs gescannt werden, mit oder ohne Normalgewebe, Lymphknotenmetastasen und Lebermetastasen und möglicherweise eine zusätzliche Rutsche conTaining normalen Schleimhaut. Bis zu 10 verschiedene Magazine können vollständig in die Dia-Scanner eingelegt werden; daher 250 gleitet in einem einzigen Durchlauf abgetastet werden. Zeit zum Abtasten und digitale Foliengröße variiert mit den Abmessungen des Gewebes und der gewünschten Qualitätsfaktor. Der Qualitätsfaktor reicht von 0 bis 100. Hier wird ein Qualitätsfaktor von 60 gewählt, da sie eine geringere Scandateigröße produziert ohne spürbaren Verlust von Scan-Qualität. Kleine Biopsien in weniger als 30 s abgetastet werden, wobei ganze Gewebeschnitte, wie die, die in diesem Beispiel verwendet wird, kann zwischen 2 und 10 min dauern. Digitale Dia-Größe kann auch im Bereich von 2 MB bis 2 GB. Mit Hilfe eines Qualitätsfaktor von 60, scannt zwischen 600 MB und 1 GB hergestellt. Zwischen 402 und 536 Objektträger werden für dieses Projekt in Höhe von 3 Scanläufe erforderlich. Jeder Lauf wird über Nacht durchgeführt. Ca. 500 GB Speicherplatz benötigt wird. Die Objektträger werden direkt auf eine digitale Plattform namens Fall Zentrum gescannt (ngtma.unibe.pathcasecenter). Fall Center ist von überall zugänglich mit Internet-Zugang durch Eingabe der benannten Benutzername und Passwort. Anmerkung Für Anmerkungen, sollten zwei Aspekte berücksichtigt werden: 1) verschiedene Gewebebereiche sollten verschiedene Farben Annotation gegeben werden und 2) die Anzahl der Anmerkungen sollte die Anzahl der gewünschten Kopien des endgültigen ngTMA zu reflektieren. In diesem Fall haben 3 Punkte pro Tumorbereich für eine einzelne Kopie ausgewählt. Für 2 Kopien, muss jede Region mit 6 Spots annotiert werden. Nützlich sind grün für normale Gewebe, blau für die Tumorzentrum, gelb für die Tumorinvasionsfront, rot für Bereiche Tumorknospung (Tumor / Stroma) Interaktion, schwarz für Lymphknotenmetastasen, türkis für Fernmetastasen und schließlich weiß für Regionen zu sein für Rohre verwendet. Annotation von jeweils 2-3 Minuten benötigt. ngTMA Bau Diese Studie benötigt 6 ngTMA Blöcke to in 2 Kopien aufgebaut werden, was in 12 abschließenden Blöcken. Die maximale Anzahl der Empfänger, die durch die Blöcke Arrayer unterstützt werden kann, ist 12. Jede Tumor Block 402 Gewebe Spots beinhalten und jedes normale Gewebe Block 268 Spots, in Höhe von insgesamt 4.556 Spots im gesamten Projekt enthalten. Ein TMA Layout wird für jeden Empfänger Block erstellt, und das Projekt wird gespeichert (6A, 6B). 60 Gewebeblöcke in das Gewebe Microarray parallel geladen werden; ein Bild von jedem Spender Block genommen wird. Beginnend mit dem ersten Spenderblock, wird der entsprechende kommentierte digitale Dia von Case-Center abgerufen werden. Slide Anpassung durchgeführt, die zwischen 1-3 Minuten dauern kann. Anmerkungen werden bestätigt und die Arrayer wird aufgefordert, beginnen Stanzen (Abbildung 7). Kern Stanz-und Transferzeit beträgt etwa 12 Sekunden. Verlust der Kerne während dieses Verfahrens ist gering. Gesamtzeit zum Ordnen dieses Projekt beträgt etwa 24 Stunden, einschließlich der Zeit für slide / Block-Matching und Nachladen des Instruments. Einige Beispiele für ngTMA sind in 8A dargestellt. Kerne für die nachfolgende molekulare Analyse kann auch zu diesem Zeitpunkt (8B) ausgestanzt werden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. a) Ein &quot;Spender&quot;-Block. Kerne aus dem Spenderblock ausgestanzt und in B) einen Empfänger Block oder Tissue Microarray (TMA) übertragen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Die herkömmliche Tissue Microarray-Workflow. A) histologischen Präparaten aus dem Archiv abgerufen und B) an den Pathologen f gegeben<html> oder Bewertung. CD) Anmerkungen werden auf den Folien, die den &quot;geschätzten&quot; Region für die Übertragung aus E.) Die entsprechenden Gewebeblöcke abgerufen werden. F) Block und Rutsche für passenden Vergleich, der G kann), manchmal eine schwierige Aufgabe sein. HJ ) Gewebemikroarray dann stattfindet. K) Kerne werden immer wieder übergeben und L) eine endgültige TMA aufgebaut ist. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. a) bis zu 25 Dias in jedem Magazin für das Scannen. B) Anpassung der Qualitätsfaktor gesetzt und Größe hergestellt werden können. Scanfortschritt überwacht werden kann. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Abbildung 4. A) gescannten Dias können auf die web-basierte Plattform, Fall Center. B) Digitale Folien angezeigt werden können hochgeladen werden. Die TMA-Annotation Tool ermöglicht dem Benutzer, die Kerngröße und Farbe für Annotation. C erforderlich) Anmerkungen können direkt auf die digitale Folie platziert werden soll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. a) bis zu 60 Blöcke in das Gewebe Microarray, nämlich 10 Spenderblöcke pro Zeile und 12 Empfänger Blöcken sowie B) Ein Bild von jedem Spender-Block. Geladen werden können, wird genommen, die digital Schieber abgerufen. Abstimmung von Block und Rutsche ist getan und Anmerkungen werden für Block Stanzen. C) Der Fortschritt der Anordnungs kann überwacht werden, während das Gerät Stanzen. D) nach dem Stanzen durchgeführt wird, ein Export der Standort jeder Stelle im Layout, aber auch ein Bild von jedem Spender Block mit entsprechenden Anmerkungen gemacht. <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6. Diese TMA-Layouts wurden Anordnen der A) Tumorblöcke und B) normalen Geweben verwendet. <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500" /> Abbildung 7. Screenshot der Microarray-Gewebe-Software. Auf der linken Seite, 12 refänger Blöcke können in dem Gerät angeordnet werden. Auf dem Boden, werden die Bilder der einzelnen Spenderblock übernommen. In der Mitte, der TMA-Layout wird der Fortschritt der Stanz sowie vergrößerte Bilder der einzelnen Spenderblock mit Anmerkungen gefunden. <img alt="Figur 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500" /> Abbildung 8. A) Einige Beispiele für neu erstellte ngTMA Blöcke. B) Weitere Schläge Gewebe können für nachfolgende molekulare Analyse entnommen werden. Diese Kerne ausgestanzt und in 0,2 ml-Röhrchen gegeben. <img alt="Figur 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600" /> Abbildung 9. Beispiele für ngTMA Biomarker-Anwendungen. A) Immunhistochemie-Färbung von Ki67 in der Darmkrebs. Dual HER2 Immunhistochemie / in situ-Hybridisierungsassay, welches B) geringe Expression des Proteins (braun) und keine Amplifikation des HER2-Gens (schwarz) relativ zu dem Zentromer (rot), c) eine hohe Expression des Proteins (braun) und HER2-Genamplifikation ( schwarz), bezogen auf Zentromer (rot). D) Chromogene in situ Hybridisierung Her2 single mRNA-Transkripte in der Brustkrebs ngTMA. E) Immunhistochemie für CD8 in Darmkrebs. F) Doppel Immunhistochemie-Färbung für pan-Zytokeratin-Marker AE1 / AE3 (braun, Tumorzellen) und CD68 (rot;. Makrophagen) Hervorhebung Tumor-Mikroumgebung in der Darmkrebs <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Das Protokoll zielt auf die Optimierung der Konstruktion und Qualität der Gewebe-Mikroarrays für Biomarker-Forschung. Es umfasst Aspekte der Planung und Design, digitale Pathologie, virtuellen Schiebe Anmerkungen und automatisierte Gewebeanordnungs.

Eine Next-Generation Tissue Microarray (ngTMA) Protokoll zur Biomarker-Studien

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

23.8K Aufrufe.  University of Bern.  Das Protokoll zielt auf die Optimierung der Konstruktion und Qualität der Gewebe-Mikroarrays für Biomarker-Forschung. Es umfasst Aspekte der Planung und Design, digitale Pathologie, virtuellen Schiebe Anmerkungen und automatisierte Gewebeanordnungs. 

Serie: A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

Die Trier Social Stress Test-Protokoll zur Induktion psychischer Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Forschung

Medizin

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full thickness corneal transplantation has been the treatment to restore sight in those limited by corneal disease. Some disadvantages to this approach include a high degree of post-operative astigmatism, lack of predictable refractive outcome, and disturbance to the ocular surface. The development of Descemet's stripping endothelial keratoplasty (DSEK), transplanting only the posterior corneal stroma, Descemet's membrane, and endothelium, has dramatically changed treatment of corneal endothelial disease. DSEK is performed through a smaller incision; this technique avoids 'open sky' surgery with its risk of hemorrhage or expulsion, decreases the incidence of postoperative wound dehiscence, reduces unpredictable refractive outcomes, and may decrease the rate of transplant rejection3-6.
Initially, cornea donor posterior lamellar dissection for DSEK was performed manually1 resulting in variable graft thickness and damage to the delicate corneal endothelial tissue during tissue processing. Automated lamellar dissection (Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK) was developed to address these issues. Automated dissection utilizes the same technology as LASIK corneal flap creation with a mechanical microkeratome blade that helps to create uniform and thin tissue grafts for DSAEK surgery with minimal corneal endothelial cell loss in tissue processing.
Eye banks have been providing full thickness corneas for surgical transplantation for many years. In 2006, eye banks began to develop methodologies for supplying precut corneal tissue for endothelial keratoplasty. With the input of corneal surgeons, eye banks have developed thorough protocols to safely and effectively prepare posterior lamellar tissue for DSAEK surgery. This can be performed preoperatively at the eye bank. Research shows no significant difference in terms of the quality of the tissue7 or patient outcomes8,9 using eye bank precut tissue versus surgeon-prepared tissue for DSAEK surgery. For most corneal surgeons, the availability of precut DSAEK corneal tissue saves time and money10, and reduces the stress of performing the donor corneal dissection in the operating room. In part because of the ability of the eye banks to provide high quality posterior lamellar corneal in a timely manner, DSAEK has become the standard of care for surgical management of corneal endothelial disease.
The procedure that we are describing is the preparation of the posterior lamellar cornea at the eye bank for transplantation in DSAEK surgery (Figure 1).

Endothelial corneal transplantation is a surgical technique for treatment of posterior corneal diseases. Mechanical microkeratome dissection to prepare tissue results in thinner, more symmetric grafts with less endothelial cell loss and improved outcomes. Dissections can be performed at the eye bank prior to corneal transplantation surgery.

Corneal Spendergewebe Vorbereitung für Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Collection Protocol for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation of pancreas recovered from cadaveric organ donors. The pancreas is divided into 3 main regions (head, body, tail) followed by serial transverse sections throughout the medial to lateral axis. Alternating sections are used for fixed paraffin and fresh frozen blocks and remnant samples are minced for snap frozen sample preparations, either with or without RNAse inhibitors, for DNA, RNA, or protein isolation. The overall goal of the pancreas dissection procedure is to sample the entire pancreas while maintaining anatomical orientation.
Endocrine cell heterogeneity in terms of islet composition, size, and numbers is reported for human islets compared to rodent islets 1. The majority of human islets from the pancreas head, body and tail regions are composed of insulin-containing &beta;-cells followed by lower proportions of glucagon-containing &alpha;-cells and somatostatin-containing &delta;-cells. Pancreatic polypeptide-containing PP cells and ghrelin-containing epsilon cells are also present but in small numbers. In contrast, the uncinate region contains islets that are primarily composed of pancreatic polypeptide-containing PP cells 2. These regional islet variations arise from developmental differences. The pancreas develops from the ventral and dorsal pancreatic buds in the foregut and after rotation of the stomach and duodenum, the ventral lobe moves and fuses with the dorsal 3. The ventral lobe forms the posterior portion of the head including the uncinate process while the dorsal lobe gives rise to the rest of the organ. Regional pancreatic variation is also reported with the tail region having higher islet density compared to other regions and the dorsal lobe-derived components undergoing selective atrophy in type 1 diabetes4,5.
Additional organs and tissues are often recovered from the organ donors and include pancreatic lymph nodes, spleen and non-pancreatic lymph nodes. These samples are recovered with similar formats as for the pancreas with the addition of isolation of cryopreserved cells. When the proximal duodenum is included with the pancreas, duodenal mucosa may be collected for paraffin and frozen blocks and minced snap frozen preparations.

This video demonstrates a dissection procedure for processing human pancreas into multiple storage formats. Anatomical orientation is maintained throughout the pancreatic regions to allow definition of regional islet composition and density.

Sammlung Protokoll zur menschlichen Pankreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of microvasculature at the site of inflammation. Parabiotic partners share their circulating antigens and thus are free of adverse immune reaction. First described by Paul Bert in 18641, the parabiosis surgery was refined by Bunster and Meyer in 1933 to improve animal survival2. In the current protocol, two mice are surgically joined following a modification of the Bunster and Meyer technique. Animals are connected through the elbow and knee joints followed by attachment of the skin allowing firm support that prevents strain on the sutured skin. Herein, we describe in detail the parabiotic joining of a ubiquitous GFP expressing mouse to a wild type (WT) mouse. Two weeks after the procedure, the pair is separated and GFP positive cells can be detected by flow cytometric analysis in the blood circulation of the WT mouse. The blood chimerism allows one to examine the contribution of the circulating cells from one animal in the other.

Parabiotic joining of two organisms leads to the development of a shared circulatory system. In this protocol, we describe the surgical steps to form a parabiotic connection between a wild-type mouse and a constitutive GFP-expressing mouse.

Parabiose in Mäuse: Ein detailliertes Protokoll

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

Microarray-basierte Identifizierung von Einzel HERV Expression Loci: Anwendung auf Biomarker Discovery in Prostatakrebs

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

Sammlung und Extraktion von DNA-Speichel für Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that cause tissue degeneration during ageing. Cancer, with incidence rates greatly increasing with age, is characterized by short telomere lengths and high telomerase activity. To study the roles of telomere dysfunction and telomerase reactivation in ageing and cancer, the protocol shows how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)-inducible TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) and Lox-Stopper-LoxTERT (LSL-mTERT). The protocol describes the procedures to induce telomere dysfunction and reactivate telomerase activity in mTERT-ER and LSL-mTERT mice in vivo. The representative data show that reactivation of telomerase activity can ameliorate the tissue degenerative phenotypes induced by telomere dysfunction. In order to determine the impact of telomerase reactivation on tumorigenesis, we generated prostate tumor model G4 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERTL/L and thymic T-cell lymphoma model G4 Atm-/- mTERTER/ER. The representative data show that telomerase reactivation in the backdrop of genomic instability induced by telomere dysfunction can greatly enhance tumorigenesis. The protocol also describes the procedures used to isolate neural stem cells (NSCs) from mTERT-ER and LSL-mTERT mice and reactivate telomerase activity in NSCs in vitro. The representative data show that reactivation of telomerase can enhance the self-renewal capability and neurogenesis in vitro. Finally, the protocol describes the procedures for performing telomere FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) on both mouse FFPE (Formalin Fixed and Paraffin Embedded) brain tissues and metaphase chromosomes of cultured cells.

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Verwendung Murine induzierbare Telomerase Allele in den Studien von Tissue Degeneration / Regeneration und Krebs

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the knees by using different forms of mesenchymal stem cells (MSCs). In Korea, bone marrow concentrates and cord blood-derived stem cells have been approved by the Korean Food and Drug Administration (KFDA) for cartilage regeneration. In addition, an adipose tissue-derived stromal vascular fraction (SVF) has been allowed by the KFDA for joint injections in human patients. Autologous adipose tissue-derived SVF contains extracellular matrix (ECM) in addition to mesenchymal stem cells. ECM excretes various cytokines that, along with hyaluronic acid (HA) and platelet-rich plasma (PRP) activated by calcium chloride, may help MSCs to regenerate cartilage and improve knee functions. In this article, we presented a protocol to improve knee functions by regenerating cartilage-like tissue in human patients with OA. The result of the protocol was first reported in 2011 followed by a few additional publications. The protocol involves liposuction to obtain autologous lipoaspirates that are mixed with collagenase. This lipoaspirates-collagenase mixture is then cut and homogenized to remove large fibrous tissue that may clog up the needle during the injection. Afterwards, the mixture is incubated to obtain adipose tissue-derived SVF. The resulting adipose tissue-derived SVF, containing both adipose tissue-derived MSCs and remnants of ECM, is injected into knees of patients, combined with HA and calcium chloride activated PRP. Included are three cases of patients who were treated with our protocol resulting in improvement of knee pain, swelling, and range of motion along with MRI evidence of hyaline cartilage-like tissue.

Here, we present a protocol to produce an adipose tissue-derived stromal vascular fraction and its application to improve knee functions by regenerating cartilage-like tissue in human patients with osteoarthritis.

Klinisches Protokoll zur Herstellung von Fettgewebe abgeleitet Stromazellen vaskulären Bruchteil für potenzielle Knorpelregeneration

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Observational Study Protocol for Repeated Clinical Examination and Critical Care Ultrasonography Within the Simple Intensive Care Studies

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) may detect adverse events of interventions such as fluid overload at an early stage. The Simple Intensive Care Studies (SICS) is a research line that focuses on the prognostic and diagnostic value of combinations of clinical variables.
The SICS-I specifically focused on the use of clinical variables obtained within 24 h of acute admission for prediction of cardiac output (CO) and mortality. Its sequel, SICS-II, focuses on repeated evaluations during ICU admission. The first clinical examination by trained researchers is performed within 3 h after admission consisting of physical examination and educated guessing. The second clinical examination is performed within 24 h after admission and includes physical examination and educated guessing, biochemical analysis and CCUS assessments of heart, lungs, inferior vena cava (IVC) and kidney. This evaluation is repeated at days 3 and 5 after admission. CCUS images are validated by an independent expert, and all data is registered in an online secured database. Follow-up at 90 days includes registration of complications and survival status according to patient&#39;s medical charts and the municipal person registry. The primary focus of SICS-II is the association between venous congestion and organ dysfunction.
The purpose of publishing this protocol is to provide details on the structure and methods of this on-going prospective observational cohort study allowing answering multiple research questions. The design of the data collection of combined clinical examination and CCUS assessments in critically ill patients are explicated. The SICS-II is open for other centers to participate and is open for other research questions that can be answered with our data.

Structured protocols are necessary to provide answers on research questions in critically ill patients. The Simple Intensive Care Studies (SICS) provides an infrastructure for repeated measurements in critically ill patients including clinical examination, biochemical analysis and ultrasonography. SICS projects have specific focus but the structure is flexible to other investigations.

Beobachtungsstudie Protokoll für wiederholte klinische Untersuchung und kritische Care Sonographie innerhalb der einfachen Intensivpflege-Studien

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) ...

A Porcine Heterotopic Heart Transplantation Protocol for Delivery of Therapeutics to a Cardiac Allograft

Cardiac transplantation is the gold standard treatment for end-stage heart failure. However, it remains limited by the number of available donor hearts and complications such as primary graft dysfunction and graft rejection. The recent clinical use of an ex vivo perfusion device in cardiac transplantation introduces a unique opportunity for treating cardiac allografts with therapeutic interventions to improve function and avoid deleterious recipient responses. Establishing a translational, large-animal model for therapeutic delivery to the entire allograft is essential for testing novel therapeutic approaches in cardiac transplantation. The porcine, heterotopic heart transplantation model in the intraabdominal position serves as an excellent model for assessing the effects of novel interventions and the immunopathology of graft rejection. This model additionally offers long-term survival for the pig, given that the graft is not required to maintain the recipient's circulation. The aim of this protocol is to provide a reproducible and robust approach for achieving ex vivo delivery of a therapeutic to the entire cardiac allograft prior to transplantation and provide technical details to perform a survival heterotopic transplant of the ex vivo perfused heart.

We present a protocol for utilizing a normothermic ex vivo sanguinous perfusion system for the delivery of therapeutics to an entire cardiac allograft in a porcine heterotopic heart transplant model.

Ein porcines heterotopes Herztransplantationsprotokoll für die Abgabe von Therapeutika an ein kardiales Allotransplantat

Cardiac transplantation is the gold standard treatment for end-stage heart failure. However, it remains limited by the number of available donor hearts ...