Die Autoren danken Dr. Brent Harris für die Bereitstellung von kritischen Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Studien wurden an der Lombardi Comprehensive Cancer Center Histopathologie &amp; Tissue Gemeinsame Ressource, die zum Teil von NIH / NCI Zuschuss P30-CA051008 unterstützt wird durchgeführt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder die National Institutes of Health.

1. Konstruktion des Spots <ol><li> Zugeben von 50 mg Rinderserumalbumin (BSA) auf 1 ml Gewebemarkierungsfarbstoff in einem 15 ml konischen Röhrchen oder 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Vortex für 1 min oder bis vollständig gelöst. Hinweis: Bei diesem Protokoll verwenden biochemischen Grade BSA. Während andere Qualitäten und Reinheiten nicht getestet wurden, ist zu erwarten, dass Grad und Reinheit nicht einen erheblichen Einfluss auf den Erfolg der Stelle haben. </li><li> Wärme 9 ml Hydroxyethyl Agarose-Gel Verarbeitung in einem 15 ml konischen Röhrchen in der Mikrowelle bei 30% Leistung für 10 Sekunden-Schritten, bis das Gel vollständig geschmolzen ist. </li><li> Kombinieren Sie die geschmolzen Verarbeitung Gel und Farbstoff-BSA-Lösung in einem 15 ml konischen Röhrchen und mischen mit einer Pipette. Vortex die Lösung. </li><li> Legen Sie die konische Röhrchen in einem Kühlschrank für ein paar Stunden oder bis solide. </li><li> Verwenden Sie einen langen, dünnen, Metallspachtel oder Sonde vorsichtig lassen Sie die farbigen Gels Stecker aus der konischen Rohr. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell oder einer Rasierklinge zu Cut das Gel stecken quer in 5 mm dicke Schnitte. Entfernen Sie die abgerundeten Enden und als Abfall zu entsorgen (Abbildung 2A). </li><li> Legen Sie die Gel-Steckteile flach in der Histologie Kassetten und halten in 70% Ethanol für 1 Stunde. Ändern Sie die 70% Ethanol-Lösung alle 2-4 h für mindestens 3 Veränderungen über einen Zeitraum von 24 Std. </li><li> Manuell bearbeiten die Gel Schnitte durch eine Ethanolreihe (1 Std jeden: 70% Ethanol, 80% Ethanol, 95% Ethanol, 100% Ethanol (3x Änderungen), so klar in Clearing-Lösung 3x 1 Stunde jeweils (beispielsweise aliphatische Kohlenwasserstoffe ( Xylole Ersatz)) wurden in diesem Protokoll verwendet werden, sind auch akzeptabel Xylole) und Infiltrat mit geschmolzenem Paraffin (3x für jeweils 1 Stunde), entweder manuell oder in einem Gewebe processer. Hinweis: Vor dem vollständigen Dehydratisierung in 100% Ethanol, kann der Farbstoff aus dem Gel Stopfen, andere Gewebe und die flüssigen Reagenzien, die in einem automatischen Gewebeprozessor beeinflussen könnten lecken. Als solche manuelle Rehydrierung wird dringend empfohlen, ist aber die automatisierte Verarbeitung equVerbündeter wirksam. </li><li> Betten Sie mehrere bearbeitete Gel Abschnitte mit Standard-Paraffineinbettung Methodik (2B). Lassen Sie Blöcke zu kühlen und zu härten und dann auf Raumtemperatur kommen. </li><li> Verwenden Sie eine dermale punch Nadel der gewünschten Größe zu erkennen Kerne von den Embedded-Gel-Abschnitte zu entfernen, bis der Block erschöpft ist (2C). Ein einzelner Block können vorsehen, bis zu 20 x 2 mm 2 Adern. Bewahren Sie die Kerne in einem kühlen Ort. Verwenden dermale Punsch in diesem Protokoll finden Sie Zahlen, ein 1,5 mm (1D und 2D) oder eine 2 mm (1B, 1C und 2C). </li></ol> 2. Mit Plätze Orient Non-Array-Blöcke <ol><li> Erstellen Sie eine Gewebeorientierungsdiagramm, um die gewünschten Positionen und Identitäten aller der einzelnen Gewebestücke zusammen eingebettet werden, und die Position des Spots zeigen. HINWEIS: Das Gewebe ist eine Orientierungsdiagramm veranschaulicht, die die Karte enthält physical Orte aller Gewebestücke mit Kennungen und der Lage der Stelle markiert. Es kann elektronisch erstellt werden oder können von Hand gezeichnet sein. Das Diagramm sollte mit welche Methode am besten für die Techniker und Forscher mit dem Endprodukt geschaffen werden. Diese Karte wird als Leitfaden für den Forscher dienen so Proben können leicht während mikroskopische Analyse identifiziert werden. Der in diesem Protokoll verwendete Karte wurde von Hand gezeichnet. Es zeigt einen Gewebeblock und Objektträger aus Glas mit jedem Gewebestück und der Stelle gezogen und in der gleichen Position wie die tatsächliche Gewebeblock und Objektträger markiert. </li><li> Die Gewebestücke zu verarbeiten in der Regel, um sicherzustellen, dass sie bleiben, richtig in den Hochrechnungs und Verarbeitungsschritte identifiziert. Für dieses Protokoll zu verarbeiten, das Gewebe 1 h lang jeweils in 70% Ethanol, 80% Ethanol, 95% Ethanol, 100% igem Ethanol (x3 Änderungen), aliphatische Kohlenwasserstoffe (Xylole Ersatz) (x3 Änderungen), und geschmolzenes Paraffin bei Gewebeinfiltration 60 ° C (x3 Änderungen). HINWEIS: Einll Gewebe sollten folgende Standard-Histologie Laborverfahren verarbeitet werden. Dies kann aufgrund der individuellen variablen Laborverfahren, Gewebe Größe und Art, aber dies hat keinen Einfluss auf die Fähigkeit, den Platz als Orientierungshilfe verwenden. </li><li> Vereinbaren Gewebestücke auf der Einbettung Station in den richtigen Stellen zugeordnet entsprechend der Gewebeorientierungsdiagramm. Verwenden Sie die Gewebeorientierungsdiagramm als Referenz, um den Techniker auf, wie man vor Ort und Gewebestücke in jedem Block arrangieren zu führen. HINWEIS: In diesem Protokoll die Einbettung Techniker setzen die handgezeichneten Orientierungskarte neben der Einbettung Station und angeordnet, die Gewebestücke auf der Einbettung Station in genau der gleichen Anordnung wie im Diagramm gezeichnet. Dies stellt sicher, dass alle Gewebestücke in dem Endprodukt vollständig identifizierbar bleiben. Das ist absolut entscheidend für den erfolgreichen Einsatz von Multi-Gewebeblöcke. </li><li> Stellen Sie sicher, der Stelle Kern ist größer als alle Gewebestücke in den Block eingebettet werden. </li><li> Betten Sie die Gewebestücke und dann die Stelle auf Ende (quer) an der richtigen Stelle nach dem Gewebeorientierungsdiagramm mit Standard-Einbettung Methodik. Bei Bedarf halten der Stelle (n) mit einer Pinzette aufrecht, bis das Paraffin hat genug, dass der Stelle (n) wird nicht umfallen (1-2 min) verfestigt. </li><li> Section und schmutzParaffinSchnitten mit vor Ort mittels Standardverfahren. <ol><li> Ermöglichen, dass die Abschnitte auf dem Wasserbad bei 40 ° C schweben und auf eine positiv geladene Glasobjektträger geklebt (ungeladenen Folien wurden nicht getestet). Trocknet die Folien in einem Trockenofen bei 60 ° C für mindestens 20 min. </li><li> Objektträger in einem Färbeautomaten und verarbeitet werden durch die folgenden Reagenzien: Xylole (Xylole 1-5 min, Xylole 2 und 3-2 min, jeweils), 100% iges Ethanol (2 min), 95% Ethanol (1 min), 80 % Ethanol (30 sec), 70% Ethanol (30 sec), unter laufendem Leitungswasser (2 min), Hämatoxylin (1,5 min), fließendem Wasser (3 min), Säure-Alkohol (1 min), unter laufendem Leitungswasser (2 min ), bluing Reagenz (1 min), Fließwasser (2 min), 80% Ethanol (30 sec), Eosin (1 min), fließendes Wasser (10 sec), 80% Ethanol (1 min), 100% Ethanol (3 ändert, 2 min jeweils), Xylole (3 Änderungen, die jeweils 30 sec). </li><li> Decken Sie die Objektträger mit Deckgläser, mit Montagemedium montiert. HINWEIS: In diesem Protokoll die geschnittene histotechnician das Paraffinblöcken auf einem Mikrotom in 5 um Abschnitte. Aus diesem Protokoll verwendeten wir einen Färbeautomaten jedoch kann gleich Ergebnisse über manuelle Färbung erhalten werden. </li></ol></li></ol> 3. Platz in TMAs (Manual TMA Kit) <ol><li> Erstellen Sie eine Gewebeorientierungsdiagramm, wie in 2.1 beschrieben, und den gewünschten Standort (e) des Spot zuweisen. </li><li> Füllen Sie den TMA Form mit geschmolzenem Paraffin bei einer Einbettung Station. Wenn die Form Abkühlen einbetten der Stelle (n) am Ende in den Rändern des TMA Form bei den von der Gewebeorientierungsdiagramm angezeigt gewünschten Stellen. Bei Bedarf halten der Stelle (n) mit einer Pinzette aufrecht, bis die Paraffin has erstarrt genug, dass der Stelle (n) wird nicht umfallen (1-2 min). </li><li> Montieren Sie die TMA-Kerne nach den Anweisungen des Herstellers und im Hinblick auf die Lage von der Stelle (n) in den Array-Margen (2D), und folgen Sie Standard Schnitte und Färbeprotokollen. HINWEIS: Bitte beachten Sie Schritt 2.6, um die Schnitte und Färbemethoden in diesem Protokoll verwendet sehen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Erfolgreiche Vorbereitung und Nutzung der Spots erfordert eine sorgfältige Einhaltung der wenigen technischen Schritte. Schmelzen des Hydroxyethyl Agarose sollte langsam und bei schwacher Hitze durchgeführt werden. Schnell Schmelzen bei hoher Hitze kann in gewissen Zusammenbruch der Agarose weniger als optimalen Ergebnissen führen. Beim Schneiden der farbstoffbeladenen Stecker in Stücke für die Verarbeitung, dass die Dicke jedes Teils größer ist als 4,5 mm und nicht mehr als 7 mm betragen. Die abgerundeten Enden ...

Die Fähigkeit, Gewebeproben von mehreren Personen in einem einzigen Paraffinblock einzubetten ermöglicht eine einfache Side-by-Side-Vergleich zwischen den Behandlungen und Einzelpersonen, eliminiert die Variabilität zwischen den Folien, und verringert die Kosten und Arbeitsbelastung der Schneiden und Färben von Proben. Diese Mehrgewebeblöcke werden typischerweise entweder als Gewebe-Mikroarrays (TMA) oder Paraffinblöcken, die Gewebe aus mehreren Individuen in einem nicht-Array-Layout erzeugt wird. Aufrechterhaltung der Probenidentität ist entscheidend für den Erfolg eines jeden Multigewebeanalyse. Forscher verwendet haben TMAs seit ihrer Entwicklung, um die Effizienz der Analyse zu verbessern, Variation zwischen den Folien zu reduzieren, sparen wertvolle Gewebe Ressourcen und die Zeit und die Kosten für die Experimente 1 zu reduzieren. Korrekte Orientierung TMA kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren erreicht werden, einschließlich Leerzeichen, Zeilen oder Spalten zwischen Gewebekerne 2-4, asymmetrische Anordnung der Kerngruppen 3, 5 (zB control vs. Behandlung), &quot;Leuchtturm&quot; Kerne 6 und bezeichnet Orientierung Kerne außerhalb des TMA Matrix 3 entfernt. Obwohl diese Verfahren eignen sich gut für TMAs meisten verbrauchen wertvolle TMA Kernraum und TMAs mit Lücken und Räume als Bezeichner kann verwirrend werden als Gewebekerne werden im Laufe der Zeit erschöpft. Darüber hinaus sind diese Verfahren nicht für die Verwendung in Mehrgewebeblöcke falls ohne ein Array-Format, da sie von Anomalien in der dicht geordneten Muster einheitlicher Mikroarraykerne als Bezeichner verlassen. Die meisten nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke müssen ungleichmäßige Gewebe aufnehmen und per Definition nicht die strukturierte Anordnung Raster, das diese Aberrationen stehen als Wahrzeichen macht anzuzeigen. Obgleich es viele Vorteile bei der Verwendung eines TMA, einer der größten Nachteile ist die geringe Größe der Kerne, die nicht immer repräsentativ weitgehend heterogenes Gewebe 1. Nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke bieten viele ter profitiert von einem TMA, aber größere Gewebeproben oder ganze Organe aus Tierversuchen enthalten. Tissue Microarrays unter Verwendung von Einzeladern haben unterschiedliche Konkordanz mit ganzen Gewebeschnitte auf der Basis des Proteins von Interesse und viele erfordern mehrere Kerne für erhöhte Konkordanz 7-11. Aufgrund der Komplexität und heterogene Natur einiger Biomarker Phänotypen TMAs Verwendung auch eine große Anzahl von Kernen (&gt; 10) kann immer noch unzureichend sein, und sie können andere als Mikroarrays für die Analyse 8 Methoden erfordern. Zusätzlich ist TMA Bau zeitaufwendig, technisch anspruchsvoll und erfordert die Anfangskosten und Investitionen in oder Zugang zu einem Gewebe Arrayer. Nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke können in jeder Grundlabor mit deutlich weniger Zeit und Mühe gemacht werden und ist eine gute Alternative für die Studien, die mehr erfordern als Gewebe-Arrays ermöglichen oder als Mittel zur Kostensenkung und Analyse zu vereinfachen. Nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke ähnlich erfordern eine zuverlässige oderientation Marker Probenidentifikation zu verfolgen, aber die Entwicklung dieser Marker wurde begrenzt. Ein Großteil der Literatur beschreibt Gewebe Ausrichtung konzentriert sich auf die korrekte physiologische Orientierung für einzelne Gewebestücke wie Tätowieren des Gewebes mit Tinte 12 Einbetten, pre-Einbettung Gewebe in Agar-Gelatine vor der Verarbeitung 13 und Kennzeichnung bestimmter Gewebe mit Kerben 14 oder Nähte 15 . Obwohl funktionsfähig, sind diese Verfahren nicht ideal als Marker in mehreren Gewebeblöcken aufgrund ihrer Beschränkungen. Eine Naht wird durch schnell geschnitten werden und können nicht in jedem Abschnitt sichtbar sein. Pre-Einbettungstechniken Verwendung von Agar-Gelatine kann das Gewebe in der richtigen Ausrichtung während der Verarbeitung und Einbettung zu halten, aber nicht einen visuellen Hinweis, zwischen mehreren Proben in dem Paraffinblock und Folien zu unterscheiden. Kerben oder Farbstoff auf dem Gewebe Analyse erschweren oder zu verschließen wichtigen morphologischen Details. Alternativ Gewebe Identitätin einem nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblock kann durch die Einbettung von Gewebestücke in einer asymmetrischen Anordnung gehalten werden, aber das 3 oder mehr Gewebestücke benötigt und möglicherweise nicht für eine optimale Anordnung der Gewebe für die Analyse zu ermöglichen. Die Probe Orientierung Tag (vor Ort) wurde als ein einfaches und kostengünstiges Verfahren, um Gewebe in mehreren Gewebeblöcke eindeutig identifizieren entwickelt und bietet viele Vorteile gegenüber bestehenden Methoden Orientierung. Der Spot ist eine kleine, bunt, Kern Hydroxyethyl Agarose-Gel-Verarbeitung und Gewebemarkierungsfarbstoff, komponiert und mit Paraffin (2C) infiltriert. Der Spot Kern auf Ende eingebettet neben einem einzigen Gewebe in einem Multi-Gewebe Paraffinblock und erscheint als bunten Punkt im Block und in jedem Abschnitt (1A - D), unter Angabe des korrekten Ausrichtung des Blocks und Sektionen für die einfache Gewebeidentifikation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HistogelTM Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marking Dye</td>
			<td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TMD-5</td>
			<td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td>
			<td>Arraymold</td>
			<td>20015A</td>
			<td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

Multi-Gewebe Paraffinblöcke bieten eine hohe Durchsatzanalyse mit erhöhter Effizienz, experimentelle Einheitlichkeit und reduziertem Zeit- und Kostenaufwand. Tissue Microarrays bilden die Mehrheit der Multi-Gewebe Paraffinblöcke, sondern zunehmend die Forscher mit nicht-angeordneten Blöcken mit größeren Gewebe von mehreren Personen, die ohne erhebliche Investitionen in die Planung und Ausstattung bieten viele der Vorteile von Tissue Microarrays können. Eine kritische Komponente jeder Mehrgewebeanalyse ist benutzt, um jedes Gewebe zu identifizieren Orientierungsverfahren. Obwohl Verfahren existieren, um die richtige Orientierung und Identifizierung von Gewebe in mehreren Gewebeblöcken zu erhalten, die meisten sind nicht gut geeignet, um nicht in einem Array besteht, kann wertvollen Raum innerhalb einer Anordnung zu verbrauchen und / oder nur schwer in der Standard histologisches Labor herzustellen. Die Probe Orientierung Tag (vor Ort) ist eine einfache, kostengünstige Orientierungshilfe, die eindeutig in die Paraffinblocks und alle Gewebeschnitte fo sichtbar istr zuverlässige Probenidentifikation in angeordnet und nicht in einem Array-Layouts. Der Fleck liefert Vorteile gegenüber bestehenden Orientierungsverfahren für Nicht-Array-Blöcke, wie es keinen direkten Modifikation des Gewebes erfordern und sorgt für Flexibilität bei der Anordnung der Gewebestücke.

Der Spot wird als rund, hell farbigen Punkt in der Paraffinblock (1A und 2D), in allen Paraffinschnitten und bleibt auf dem Objektträger durch die H &amp; E oder IHC Färbeverfahren (1B - 1D und 2D). Dieser offensichtliche visuelle Hinweis unterstützt sowohl die histotechnician und Forscher in Identifizierung jeder einzelnen Gewebestück und vereinfacht die Kommunikation als histotechnician kann der visuelle Hinweis verwenden, um die ...

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SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Der Zweck der Probenausrichtung Tag (vor Ort) soll als Orientierungshilfe, um in einzelnen Gewebeidentifikation in multi-Gewebe Paraffinblöcke unterstützen funktionieren. Diese Protokolle zeigen, wie sie ist leicht von gemeinsamen, kostengünstigen Histologie Materialien gebaut und dient als zuverlässige visuelle Marker in Paraffinblöcke und Abschnitte.

Spot the Correct Tissue Every Time in Multi-Gewebe-Blöcke

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

spot-the-correct-tissue-every-time-in-multi-tissue-blocks

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Aufrufe.  Frederick National Laboratory for Cancer Research.  Der Zweck der Probenausrichtung Tag (vor Ort) soll als Orientierungshilfe, um in einzelnen Gewebeidentifikation in multi-Gewebe Paraffinblöcke unterstützen funktionieren. Diese Protokolle zeigen, wie sie ist leicht von gemeinsamen, kostengünstigen Histologie Materialien gebaut und dient als zuverlässige visuelle Marker in Paraffinblöcke und Abschnitte. 

Serie: SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Forschung

Biologie

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Die Implantation von Engineered Tissue in der Ratte Herz

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Ein System zur Kultivierung Iris Pigmentepithelzellen nach Lens Regeneration in Newt Study

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

Manipulation der Murine Lakrimal

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Spezifitätsanalyse von Protein Lysin Methyltransferasen Mit SPOT Peptidarrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Dissektion der Auditory Bulla in postnatale Mäuse: Die Isolierung der Gehörknöchelchen und histologische Analyse

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...