Name: spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks
Uploaded: 2015-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
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Die Autoren danken Dr. Brent Harris für die Bereitstellung von kritischen Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Studien wurden an der Lombardi Comprehensive Cancer Center Histopathologie &amp; Tissue Gemeinsame Ressource, die zum Teil von NIH / NCI Zuschuss P30-CA051008 unterstützt wird durchgeführt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder die National Institutes of Health.

1. Konstruktion des Spots <ol><li> Zugeben von 50 mg Rinderserumalbumin (BSA) auf 1 ml Gewebemarkierungsfarbstoff in einem 15 ml konischen Röhrchen oder 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Vortex für 1 min oder bis vollständig gelöst. Hinweis: Bei diesem Protokoll verwenden biochemischen Grade BSA. Während andere Qualitäten und Reinheiten nicht getestet wurden, ist zu erwarten, dass Grad und Reinheit nicht einen erheblichen Einfluss auf den Erfolg der Stelle haben. </li><li> Wärme 9 ml Hydroxyethyl Agarose-Gel Verarbeitung in einem 15 ml konischen Röhrchen in der Mikrowelle bei 30% Leistung für 10 Sekunden-Schritten, bis das Gel vollständig geschmolzen ist. </li><li> Kombinieren Sie die geschmolzen Verarbeitung Gel und Farbstoff-BSA-Lösung in einem 15 ml konischen Röhrchen und mischen mit einer Pipette. Vortex die Lösung. </li><li> Legen Sie die konische Röhrchen in einem Kühlschrank für ein paar Stunden oder bis solide. </li><li> Verwenden Sie einen langen, dünnen, Metallspachtel oder Sonde vorsichtig lassen Sie die farbigen Gels Stecker aus der konischen Rohr. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell oder einer Rasierklinge zu Cut das Gel stecken quer in 5 mm dicke Schnitte. Entfernen Sie die abgerundeten Enden und als Abfall zu entsorgen (Abbildung 2A). </li><li> Legen Sie die Gel-Steckteile flach in der Histologie Kassetten und halten in 70% Ethanol für 1 Stunde. Ändern Sie die 70% Ethanol-Lösung alle 2-4 h für mindestens 3 Veränderungen über einen Zeitraum von 24 Std. </li><li> Manuell bearbeiten die Gel Schnitte durch eine Ethanolreihe (1 Std jeden: 70% Ethanol, 80% Ethanol, 95% Ethanol, 100% Ethanol (3x Änderungen), so klar in Clearing-Lösung 3x 1 Stunde jeweils (beispielsweise aliphatische Kohlenwasserstoffe ( Xylole Ersatz)) wurden in diesem Protokoll verwendet werden, sind auch akzeptabel Xylole) und Infiltrat mit geschmolzenem Paraffin (3x für jeweils 1 Stunde), entweder manuell oder in einem Gewebe processer. Hinweis: Vor dem vollständigen Dehydratisierung in 100% Ethanol, kann der Farbstoff aus dem Gel Stopfen, andere Gewebe und die flüssigen Reagenzien, die in einem automatischen Gewebeprozessor beeinflussen könnten lecken. Als solche manuelle Rehydrierung wird dringend empfohlen, ist aber die automatisierte Verarbeitung equVerbündeter wirksam. </li><li> Betten Sie mehrere bearbeitete Gel Abschnitte mit Standard-Paraffineinbettung Methodik (2B). Lassen Sie Blöcke zu kühlen und zu härten und dann auf Raumtemperatur kommen. </li><li> Verwenden Sie eine dermale punch Nadel der gewünschten Größe zu erkennen Kerne von den Embedded-Gel-Abschnitte zu entfernen, bis der Block erschöpft ist (2C). Ein einzelner Block können vorsehen, bis zu 20 x 2 mm 2 Adern. Bewahren Sie die Kerne in einem kühlen Ort. Verwenden dermale Punsch in diesem Protokoll finden Sie Zahlen, ein 1,5 mm (1D und 2D) oder eine 2 mm (1B, 1C und 2C). </li></ol> 2. Mit Plätze Orient Non-Array-Blöcke <ol><li> Erstellen Sie eine Gewebeorientierungsdiagramm, um die gewünschten Positionen und Identitäten aller der einzelnen Gewebestücke zusammen eingebettet werden, und die Position des Spots zeigen. HINWEIS: Das Gewebe ist eine Orientierungsdiagramm veranschaulicht, die die Karte enthält physical Orte aller Gewebestücke mit Kennungen und der Lage der Stelle markiert. Es kann elektronisch erstellt werden oder können von Hand gezeichnet sein. Das Diagramm sollte mit welche Methode am besten für die Techniker und Forscher mit dem Endprodukt geschaffen werden. Diese Karte wird als Leitfaden für den Forscher dienen so Proben können leicht während mikroskopische Analyse identifiziert werden. Der in diesem Protokoll verwendete Karte wurde von Hand gezeichnet. Es zeigt einen Gewebeblock und Objektträger aus Glas mit jedem Gewebestück und der Stelle gezogen und in der gleichen Position wie die tatsächliche Gewebeblock und Objektträger markiert. </li><li> Die Gewebestücke zu verarbeiten in der Regel, um sicherzustellen, dass sie bleiben, richtig in den Hochrechnungs und Verarbeitungsschritte identifiziert. Für dieses Protokoll zu verarbeiten, das Gewebe 1 h lang jeweils in 70% Ethanol, 80% Ethanol, 95% Ethanol, 100% igem Ethanol (x3 Änderungen), aliphatische Kohlenwasserstoffe (Xylole Ersatz) (x3 Änderungen), und geschmolzenes Paraffin bei Gewebeinfiltration 60 ° C (x3 Änderungen). HINWEIS: Einll Gewebe sollten folgende Standard-Histologie Laborverfahren verarbeitet werden. Dies kann aufgrund der individuellen variablen Laborverfahren, Gewebe Größe und Art, aber dies hat keinen Einfluss auf die Fähigkeit, den Platz als Orientierungshilfe verwenden. </li><li> Vereinbaren Gewebestücke auf der Einbettung Station in den richtigen Stellen zugeordnet entsprechend der Gewebeorientierungsdiagramm. Verwenden Sie die Gewebeorientierungsdiagramm als Referenz, um den Techniker auf, wie man vor Ort und Gewebestücke in jedem Block arrangieren zu führen. HINWEIS: In diesem Protokoll die Einbettung Techniker setzen die handgezeichneten Orientierungskarte neben der Einbettung Station und angeordnet, die Gewebestücke auf der Einbettung Station in genau der gleichen Anordnung wie im Diagramm gezeichnet. Dies stellt sicher, dass alle Gewebestücke in dem Endprodukt vollständig identifizierbar bleiben. Das ist absolut entscheidend für den erfolgreichen Einsatz von Multi-Gewebeblöcke. </li><li> Stellen Sie sicher, der Stelle Kern ist größer als alle Gewebestücke in den Block eingebettet werden. </li><li> Betten Sie die Gewebestücke und dann die Stelle auf Ende (quer) an der richtigen Stelle nach dem Gewebeorientierungsdiagramm mit Standard-Einbettung Methodik. Bei Bedarf halten der Stelle (n) mit einer Pinzette aufrecht, bis das Paraffin hat genug, dass der Stelle (n) wird nicht umfallen (1-2 min) verfestigt. </li><li> Section und schmutzParaffinSchnitten mit vor Ort mittels Standardverfahren. <ol><li> Ermöglichen, dass die Abschnitte auf dem Wasserbad bei 40 ° C schweben und auf eine positiv geladene Glasobjektträger geklebt (ungeladenen Folien wurden nicht getestet). Trocknet die Folien in einem Trockenofen bei 60 ° C für mindestens 20 min. </li><li> Objektträger in einem Färbeautomaten und verarbeitet werden durch die folgenden Reagenzien: Xylole (Xylole 1-5 min, Xylole 2 und 3-2 min, jeweils), 100% iges Ethanol (2 min), 95% Ethanol (1 min), 80 % Ethanol (30 sec), 70% Ethanol (30 sec), unter laufendem Leitungswasser (2 min), Hämatoxylin (1,5 min), fließendem Wasser (3 min), Säure-Alkohol (1 min), unter laufendem Leitungswasser (2 min ), bluing Reagenz (1 min), Fließwasser (2 min), 80% Ethanol (30 sec), Eosin (1 min), fließendes Wasser (10 sec), 80% Ethanol (1 min), 100% Ethanol (3 ändert, 2 min jeweils), Xylole (3 Änderungen, die jeweils 30 sec). </li><li> Decken Sie die Objektträger mit Deckgläser, mit Montagemedium montiert. HINWEIS: In diesem Protokoll die geschnittene histotechnician das Paraffinblöcken auf einem Mikrotom in 5 um Abschnitte. Aus diesem Protokoll verwendeten wir einen Färbeautomaten jedoch kann gleich Ergebnisse über manuelle Färbung erhalten werden. </li></ol></li></ol> 3. Platz in TMAs (Manual TMA Kit) <ol><li> Erstellen Sie eine Gewebeorientierungsdiagramm, wie in 2.1 beschrieben, und den gewünschten Standort (e) des Spot zuweisen. </li><li> Füllen Sie den TMA Form mit geschmolzenem Paraffin bei einer Einbettung Station. Wenn die Form Abkühlen einbetten der Stelle (n) am Ende in den Rändern des TMA Form bei den von der Gewebeorientierungsdiagramm angezeigt gewünschten Stellen. Bei Bedarf halten der Stelle (n) mit einer Pinzette aufrecht, bis die Paraffin has erstarrt genug, dass der Stelle (n) wird nicht umfallen (1-2 min). </li><li> Montieren Sie die TMA-Kerne nach den Anweisungen des Herstellers und im Hinblick auf die Lage von der Stelle (n) in den Array-Margen (2D), und folgen Sie Standard Schnitte und Färbeprotokollen. HINWEIS: Bitte beachten Sie Schritt 2.6, um die Schnitte und Färbemethoden in diesem Protokoll verwendet sehen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Erfolgreiche Vorbereitung und Nutzung der Spots erfordert eine sorgfältige Einhaltung der wenigen technischen Schritte. Schmelzen des Hydroxyethyl Agarose sollte langsam und bei schwacher Hitze durchgeführt werden. Schnell Schmelzen bei hoher Hitze kann in gewissen Zusammenbruch der Agarose weniger als optimalen Ergebnissen führen. Beim Schneiden der farbstoffbeladenen Stecker in Stücke für die Verarbeitung, dass die Dicke jedes Teils größer ist als 4,5 mm und nicht mehr als 7 mm betragen. Die abgerundeten Enden ...

Die Fähigkeit, Gewebeproben von mehreren Personen in einem einzigen Paraffinblock einzubetten ermöglicht eine einfache Side-by-Side-Vergleich zwischen den Behandlungen und Einzelpersonen, eliminiert die Variabilität zwischen den Folien, und verringert die Kosten und Arbeitsbelastung der Schneiden und Färben von Proben. Diese Mehrgewebeblöcke werden typischerweise entweder als Gewebe-Mikroarrays (TMA) oder Paraffinblöcken, die Gewebe aus mehreren Individuen in einem nicht-Array-Layout erzeugt wird. Aufrechterhaltung der Probenidentität ist entscheidend für den Erfolg eines jeden Multigewebeanalyse. Forscher verwendet haben TMAs seit ihrer Entwicklung, um die Effizienz der Analyse zu verbessern, Variation zwischen den Folien zu reduzieren, sparen wertvolle Gewebe Ressourcen und die Zeit und die Kosten für die Experimente 1 zu reduzieren. Korrekte Orientierung TMA kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren erreicht werden, einschließlich Leerzeichen, Zeilen oder Spalten zwischen Gewebekerne 2-4, asymmetrische Anordnung der Kerngruppen 3, 5 (zB control vs. Behandlung), &quot;Leuchtturm&quot; Kerne 6 und bezeichnet Orientierung Kerne außerhalb des TMA Matrix 3 entfernt. Obwohl diese Verfahren eignen sich gut für TMAs meisten verbrauchen wertvolle TMA Kernraum und TMAs mit Lücken und Räume als Bezeichner kann verwirrend werden als Gewebekerne werden im Laufe der Zeit erschöpft. Darüber hinaus sind diese Verfahren nicht für die Verwendung in Mehrgewebeblöcke falls ohne ein Array-Format, da sie von Anomalien in der dicht geordneten Muster einheitlicher Mikroarraykerne als Bezeichner verlassen. Die meisten nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke müssen ungleichmäßige Gewebe aufnehmen und per Definition nicht die strukturierte Anordnung Raster, das diese Aberrationen stehen als Wahrzeichen macht anzuzeigen. Obgleich es viele Vorteile bei der Verwendung eines TMA, einer der größten Nachteile ist die geringe Größe der Kerne, die nicht immer repräsentativ weitgehend heterogenes Gewebe 1. Nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke bieten viele ter profitiert von einem TMA, aber größere Gewebeproben oder ganze Organe aus Tierversuchen enthalten. Tissue Microarrays unter Verwendung von Einzeladern haben unterschiedliche Konkordanz mit ganzen Gewebeschnitte auf der Basis des Proteins von Interesse und viele erfordern mehrere Kerne für erhöhte Konkordanz 7-11. Aufgrund der Komplexität und heterogene Natur einiger Biomarker Phänotypen TMAs Verwendung auch eine große Anzahl von Kernen (&gt; 10) kann immer noch unzureichend sein, und sie können andere als Mikroarrays für die Analyse 8 Methoden erfordern. Zusätzlich ist TMA Bau zeitaufwendig, technisch anspruchsvoll und erfordert die Anfangskosten und Investitionen in oder Zugang zu einem Gewebe Arrayer. Nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke können in jeder Grundlabor mit deutlich weniger Zeit und Mühe gemacht werden und ist eine gute Alternative für die Studien, die mehr erfordern als Gewebe-Arrays ermöglichen oder als Mittel zur Kostensenkung und Analyse zu vereinfachen. Nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblöcke ähnlich erfordern eine zuverlässige oderientation Marker Probenidentifikation zu verfolgen, aber die Entwicklung dieser Marker wurde begrenzt. Ein Großteil der Literatur beschreibt Gewebe Ausrichtung konzentriert sich auf die korrekte physiologische Orientierung für einzelne Gewebestücke wie Tätowieren des Gewebes mit Tinte 12 Einbetten, pre-Einbettung Gewebe in Agar-Gelatine vor der Verarbeitung 13 und Kennzeichnung bestimmter Gewebe mit Kerben 14 oder Nähte 15 . Obwohl funktionsfähig, sind diese Verfahren nicht ideal als Marker in mehreren Gewebeblöcken aufgrund ihrer Beschränkungen. Eine Naht wird durch schnell geschnitten werden und können nicht in jedem Abschnitt sichtbar sein. Pre-Einbettungstechniken Verwendung von Agar-Gelatine kann das Gewebe in der richtigen Ausrichtung während der Verarbeitung und Einbettung zu halten, aber nicht einen visuellen Hinweis, zwischen mehreren Proben in dem Paraffinblock und Folien zu unterscheiden. Kerben oder Farbstoff auf dem Gewebe Analyse erschweren oder zu verschließen wichtigen morphologischen Details. Alternativ Gewebe Identitätin einem nicht in einem Array mit mehreren Gewebeblock kann durch die Einbettung von Gewebestücke in einer asymmetrischen Anordnung gehalten werden, aber das 3 oder mehr Gewebestücke benötigt und möglicherweise nicht für eine optimale Anordnung der Gewebe für die Analyse zu ermöglichen. Die Probe Orientierung Tag (vor Ort) wurde als ein einfaches und kostengünstiges Verfahren, um Gewebe in mehreren Gewebeblöcke eindeutig identifizieren entwickelt und bietet viele Vorteile gegenüber bestehenden Methoden Orientierung. Der Spot ist eine kleine, bunt, Kern Hydroxyethyl Agarose-Gel-Verarbeitung und Gewebemarkierungsfarbstoff, komponiert und mit Paraffin (2C) infiltriert. Der Spot Kern auf Ende eingebettet neben einem einzigen Gewebe in einem Multi-Gewebe Paraffinblock und erscheint als bunten Punkt im Block und in jedem Abschnitt (1A - D), unter Angabe des korrekten Ausrichtung des Blocks und Sektionen für die einfache Gewebeidentifikation.

<table><tbody><tr><td>Histogel Specimen Processing Gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tissue Marking Dye</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TMD-5</td><td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td></tr><tr><td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td><td>Arraymold</td><td>20015A</td><td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td></tr></tbody></table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

Multi-Gewebe Paraffinblöcke bieten eine hohe Durchsatzanalyse mit erhöhter Effizienz, experimentelle Einheitlichkeit und reduziertem Zeit- und Kostenaufwand. Tissue Microarrays bilden die Mehrheit der Multi-Gewebe Paraffinblöcke, sondern zunehmend die Forscher mit nicht-angeordneten Blöcken mit größeren Gewebe von mehreren Personen, die ohne erhebliche Investitionen in die Planung und Ausstattung bieten viele der Vorteile von Tissue Microarrays können. Eine kritische Komponente jeder Mehrgewebeanalyse ist benutzt, um jedes Gewebe zu identifizieren Orientierungsverfahren. Obwohl Verfahren existieren, um die richtige Orientierung und Identifizierung von Gewebe in mehreren Gewebeblöcken zu erhalten, die meisten sind nicht gut geeignet, um nicht in einem Array besteht, kann wertvollen Raum innerhalb einer Anordnung zu verbrauchen und / oder nur schwer in der Standard histologisches Labor herzustellen. Die Probe Orientierung Tag (vor Ort) ist eine einfache, kostengünstige Orientierungshilfe, die eindeutig in die Paraffinblocks und alle Gewebeschnitte fo sichtbar istr zuverlässige Probenidentifikation in angeordnet und nicht in einem Array-Layouts. Der Fleck liefert Vorteile gegenüber bestehenden Orientierungsverfahren für Nicht-Array-Blöcke, wie es keinen direkten Modifikation des Gewebes erfordern und sorgt für Flexibilität bei der Anordnung der Gewebestücke.

Der Spot wird als rund, hell farbigen Punkt in der Paraffinblock (1A und 2D), in allen Paraffinschnitten und bleibt auf dem Objektträger durch die H &amp; E oder IHC Färbeverfahren (1B - 1D und 2D). Dieser offensichtliche visuelle Hinweis unterstützt sowohl die histotechnician und Forscher in Identifizierung jeder einzelnen Gewebestück und vereinfacht die Kommunikation als histotechnician kann der visuelle Hinweis verwenden, um die ...

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SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Der Zweck der Probenausrichtung Tag (vor Ort) soll als Orientierungshilfe, um in einzelnen Gewebeidentifikation in multi-Gewebe Paraffinblöcke unterstützen funktionieren. Diese Protokolle zeigen, wie sie ist leicht von gemeinsamen, kostengünstigen Histologie Materialien gebaut und dient als zuverlässige visuelle Marker in Paraffinblöcke und Abschnitte.

Spot the Correct Tissue Every Time in Multi-Gewebe-Blöcke

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Aufrufe.  Frederick National Laboratory for Cancer Research.  Der Zweck der Probenausrichtung Tag (vor Ort) soll als Orientierungshilfe, um in einzelnen Gewebeidentifikation in multi-Gewebe Paraffinblöcke unterstützen funktionieren. Diese Protokolle zeigen, wie sie ist leicht von gemeinsamen, kostengünstigen Histologie Materialien gebaut und dient als zuverlässige visuelle Marker in Paraffinblöcke und Abschnitte. 

Serie: SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Forschung

Medizin

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly with many downstream assays such as next generation sequencing. Automated tissue dissection is a new methodology that automates and improves tumor enrichment in these common, low tumor content tissues by decreasing the user-dependent imprecision of traditional macro-dissection and time, cost, and expertise limitations of laser capture microdissection by using digital image annotation overlay onto unstained slides. Here, digital hematoxylin and eosin (H&#38;E) annotations are used to target small tumor areas using a blade that is 250 &#181;m2 in diameter in unstained formalin fixed paraffin embedded (FFPE) or fresh frozen sections up to 20 &#181;m in thickness for automated tumor enrichment prior to nucleic acid extraction and whole exome sequencing (WES). Automated dissection can harvest annotated regions in low tumor content tissues from single or multiple sections for nucleic acid extraction. It also allows for capture of extensive pre- and post-harvest collection metrics while improving accuracy, reproducibility, and increasing throughput with utilization of fewer slides. The described protocol enables digital annotation with automated dissection on animal and/or human FFPE or fresh frozen tissues with low tumor content and could also be used for any region of interest enrichment to boost adequacy for downstream sequencing applications in clinical or research workflows.

Digital annotation with automated tissue dissection provides an innovative approach to enriching tumor in low tumor content cases and is adaptable to both paraffin and frozen tissue types. The described workflow improves accuracy, reproducibility and throughput and could be applied to both research and clinical settings.

Automatisiertes Dissektionsprotokoll zur Tumoranreicherung in Geweben mit niedrigem Tumorgehalt

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

Krebsforschung

Manual Construction of a Tissue Microarray using the Tape Method and a Handheld Microarrayer

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single paraffin block. This is achieved by using tissue cores extracted from the region of interest of different donor FFPE blocks and arranging them into a single TMA paraffin block. Once constructed, sections from the completed TMA can be used to perform immunohistochemistry, chromogenic, fluorescence in situ hybridization (FISH) and RNA ISH studies to assess protein expression as well as genomic and transcriptional alterations in many samples simultaneously, thus minimizing tissue usage and reducing reagent costs. There are several different TMA construction techniques. One of the most common construction methods is the recipient method, which works best with cores of the same length for which a minimum length of 4 mm is recommended. Unfortunately, tissue blocks can be heavily resected during the diagnostic process, frequently resulting in "non-ideal" donor block thicknesses of less than 4 mm. The current article and video focus on the double-sided adhesive tape method; an alternative manual, low cost, easy to use, and rapid method to construct low density (&lt;50 cores) TMAs that is highly compatible with these non-ideal donor blocks. This protocol provides a step-by-step guide on how to construct a TMA using this method, with a focus on the critical importance of pathological review and post construction validation.

This protocol outlines the tape method on how to manually construct a tissue microarray using FFPE donor blocks of differing depths.

Manueller Aufbau eines Gewebe-Microarrays mit der Tape-Methode und einem Handheld-Microarrayer

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single ...

Kartierung der Tumorimmunlandschaft: Ein detailliertes Multiplex-IHC-Analyseprotokoll

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. Multiplex immunohistochemistry is a valuable tool to visualize and identify different types of immune cells in tumor tissues while retaining its spatial information. Here we provide detailed protocols to analyze lymphocyte, myeloid, and dendritic cell populations in tissue sections. Starting from cutting formalin-fixed paraffin-embedded sections, automatic multiplex staining procedures on an automated platform, scanning of the slides on a multispectral imaging microscope, to the analysis of images using an in-house-developed machine learning algorithm ImmuNet. These protocols can be applied to a variety of tumor specimens by simply switching tumor markers to analyze immune cells in different compartments of the sample (tumor versus invasive margin) and apply nearest-neighbor analysis. This analysis is not limited to tumor samples but can also be applied to other (non-)pathogenic tissues. Improvements to the equipment and workflow over the past few years have significantly shortened throughput times, which facilitates the future application of this procedure in the diagnostic setting.

Autor im Rampenlicht: Einblicke in die Immunzelllandschaft von Tumoren

This protocol describes in detail how immune cell characterization of the tumor microenvironment using multiplex immunohistochemistry is carried out.

Immunhistochemische Multiplex-Analyse der räumlichen Immunzelllandschaft der Tumormikroumgebung

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

Entschlüsselung der Tumormikroumgebung mit mIHC beim Plattenepithelkarzinom der Lunge

Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been considered the leading cause of death in lung cancer patients. The complexity of the tumor microenvironment requires effective methods to understand cell-to-cell relationships in tumor tissues. The multiplex immunohistochemistry (mIHC) technique has become a key tool for inferring the relationship between the expression of proteins upstream and downstream of signaling pathways in tumor tissues and developing clinical diagnoses and treatment plans. mIHC is a multi-label immunofluorescence staining method based on Tyramine Signal Amplification (TSA) technology, which can simultaneously detect multiple target molecules on the same tissue section sample to achieve different protein co-expression and co-localization analysis. In this experimental protocol, paraffin-embedded tissue sections of lung squamous carcinoma of clinical origin were subjected to multiplex immunohistochemical staining. By optimizing the experimental protocol, multiplex immunohistochemical staining of labeled target cells and proteins was achieved, solving the problem of autofluorescence and channel crosstalk in lung tissues. In addition, multiplex immunohistochemical staining is widely used in the experimental validation of tumor-related, high-throughput sequencing, including single-cell sequencing, proteomics, and tissue space sequencing, providing intuitive and visual pathology validation results.

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der mehrfarbigen Fluoreszenzlokalisierung in Lungenkarzinomproben

This experimental protocol describes and optimizes a multiplex immunohistochemistry (IHC) staining method, mainly by optimizing single-channel antibody incubation conditions and adjusting the settings of antibodies and channels to solve the problems of autofluorescence and channel crosstalk in lung cancer tissues of clinical origin.

Multiplex-Immunhistochemie-Färbung für paraffineingebettetes Lungenkrebsgewebe

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

Herstellung von Tissue Microarrays, Immunhistochemie Färbung und Digitalisierung Innerhalb des Human Protein Atlas

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Spot the Correct Tissue Every Time in Multi-Gewebe-Blöcke

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Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

Automatisiertes Dissektionsprotokoll zur Tumoranreicherung in Geweben mit niedrigem Tumorgehalt

Manueller Aufbau eines Gewebe-Microarrays mit der Tape-Methode und einem Handheld-Microarrayer

Immunhistochemische Multiplex-Analyse der räumlichen Immunzelllandschaft der Tumormikroumgebung

Immunhistochemische Multiplex-Analyse der räumlichen Immunzelllandschaft der Tumormikroumgebung

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Multiplex-Immunhistochemie-Färbung für paraffineingebettetes Lungenkrebsgewebe

Multiplex-Immunhistochemie-Färbung für paraffineingebettetes Lungenkrebsgewebe

Multiplex-Immunhistochemie-Färbung für paraffineingebettetes Lungenkrebsgewebe

Herstellung von Tissue Microarrays, Immunhistochemie Färbung und Digitalisierung Innerhalb des Human Protein Atlas